Metody badań toksyczności substancji chemicznych Ustalanie ADI, badania epidemiologiczne

Toksykologia żywności Przedmiotem badań i oceny toksykologicznej są: substancje naturalnie występujące w żywności substancje stanowiące zanieczyszczenia żywności substancje lub ich mieszaniny dodawane do żywności w określonym celu (dodatki do żywności)

Badania toksykologiczne Dotyczą zazwyczaj działania określonego związku, rzadziej mieszaniny substancji znanych i bardzo rzadko mieszaniny o nieznanym składzie Badania wykonuje się na kilku gatunkach zwierząt

Zwierzęta doświadczalne Są to najczęściej: Myszy białe Szczury białe Chomiki Świnki morskie Króliki Psy Do oceny działania mutagennego Używa się bakterii i drożdży

Badania toksykologiczne- znaczenie paszy Dieta syntetyczna o stałym składzie Dieta półsyntetyczna – składająca się tylko częściowo z czystych związków chemicznych (węglowodany, aminokwasy, witaminy, składniki mineralne) oraz z oczyszczonych składników naturalnych (skrobia, cukier, kazeina)

Podawanie paszy i wody Najczęściej stosuje się podawanie paszy i wody ad libitum z jednoczesną kontrolą spożycia Substancje badane podaje się w paszy, zgłębnikiem dożołądkowo (rzadko) lub w wodzie do picia Przy badaniu wpływu metali na organizm woda powinna być dejonizowana

Badaniom powinny podlegać Związki pochodzenia naturalnego lub ich mieszaniny Związki otrzymane na drodze syntezy chemicznej lub ich mieszaniny Związki lub ich mieszaniny otrzymane na drodze syntezy biologicznej, np. preparaty enzymatyczne Nowe środki spożywcze lub preparaty, np. białkowe, tłuszczowe, ich substytuty dodawane do żywności

Zakres badań toksykologicznych Toksyczność ostra, podostra i przewlekła Działanie rakotwórcze Działanie mutagenne Działanie teratogenne i embriotoksyczne Wpływ na płodność i rozrodczość Metabolizm Synergizm i antagonizm Działanie drażniące oka i skóry Działanie alergiczne

Zasady badań toksykologicznych Do doświadczeń używa się zwierząt zdrowych, znanego szczepu i ze znanej hodowli; są to zwierzęta obu płci, młode, karmione bez ograniczeń paszą pełnowartościową zapewniającą prawidłowy wzrost i rozmnażanie

Toksyczność ostra To działanie toksyczne wywołane podaniem badanej substancji w dawce pojedynczej lub w kilku dawkach w ciągu 24 h Jej jednostką jest medialna DL50 wyrażona w mg/kg m. c. zwierzęcia

Toksyczność ostra Jej badanie przeprowadza się przynajmniej na 3 gatunkach zwierząt, młodych, o zbliżonej masie ciała np. szczury ok. 200g Substancję podaje się per os w kilku różnych dawkach, obserwuje się zwierzęta przez określony czas (co najmniej 14 dni) i liczy zwierzęta, które padły w każdej grupie

Toksyczność ostra Obserwacje powinny obejmować: początek wystąpienia, charakter i czas trwania objawów toksycznych Powinny dotyczyć: ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, oddechowego, sercowo-naczyniowego, pokarmowego, moczowo-płciowego, wyglądu skóry, błon śluzowych i oczu

Toksyczność ostra Kilka dni przed podaniem badanej substancji i do czasu zakończenia obserwacji kontroluje się masę ciała początkową i końcową oraz spożycie paszy Wykonuje się sekcję zwierząt padłych i uśpionych po zakończeniu doświadczenia oraz badania makro- i mikroskopowe narządów

Toksyczność podprzewlekła Jej badanie wykonuje się na 2 gatunkach zwierząt (1 to najczęściej szczury, a drugi nie powinien być gryzoniem) Czas trwania doświadczenia wynosi zwykle ok. 1/10 normalnego okresu życia zwierząt (szczury, myszy – 90 dni, świnie – 1 rok) Używa się młodych zwierząt (np. szczury 4-5 tyg. o masie ok. 50-60 g)

Toksyczność podprzewlekła Badaną substancję podaje się w paszy w 3-4 różnych dawkach Dawki powinny być tak dobrane aby jedna stanowiła poziom NOAEL a druga LOAEL Wielkość dawek ustala się w badaniach pilotażowych trwających ok. 4 tyg.

Toksyczność podprzewlekła Zakres badań obejmuje Badania ogólne: wygląd i ogólny stan zdrowia, zachowanie zwierząt śmiertelność (ustalenie przyczyn) codzienne spożycie paszy i wody przyrost masy ciała

Toksyczność podprzewlekła Badania hematologiczne: hematokryt zawartość hemoglobiny liczba krwinek czerwonych, białych i płytek krwi czas protrombinowy

Toksyczność podprzewlekła Badania biochemiczne: W surowicy: m.in. białko, glukozę, azot mocznikowy, TG, cholesterol, elektrolity, enzymy- ALAT, ASPAT, AP W wątrobie: białko, enzymy- ALAT, ASPAT, AP i wiele innych Badanie moczu oraz badania hematologiczne i biochemiczne wykonuje się po 2, 4 i 12 tyg. równolegle w grupach badanych i kontrolnych

Toksyczność podprzewlekła Badanie oczu – na początku i na końcu Sekcja zwierząt padłych i uśpionych po zakończeniu doświadczenia – należy zważyć wszystkie narządy i wykonać Badanie histopatologiczne – co najmniej 20-22 narządów i tkanek

Toksyczność przewlekła Dobór zwierząt jak w toksyczności podostrej Czas trwania doświadczenia – praktycznie cały okres życia zwierząt, np. dla szczurów – ok. 2 lata, myszy – 1,5 roku, świń – 5-7 lat

Toksyczność przewlekła Substancję badaną podaje się w paszy w różnych dawkach ustalonych wcześniej w badaniach toksyczności podprzewlekłej, tak aby można było wyznaczyć poziomy: NOAEL i LOAEL

Toksyczność przewlekła Obserwacje zwierząt, badania krwi, wątroby i moczu – tak jak w badaniu toksyczności podostrej po 6, 12, 18 i 24 miesiącach (dla gryzoni) Badania histopatologiczne – w zależności od wyników badań toksyczności podostrej mogą być poszerzone o inne narządy (aortę, oko, język, grasicę, ślinianki i inne)

Badanie rakotwórczości Zwierzęta: myszy i szczury młode, jak w teście podprzewlekłym, pochodzące od rodziców otrzymujących przez ok. 2 miesiące przed kojarzeniem paszę z dodatkiem badanej substancji w odpowiednich dawkach

Badanie rakotwórczości Grupy zwierząt: Kontrolna Otrzymująca dawkę maksymalną – Otrzymująca 1/3 dawki maksymalnej Otrzymująca 1/9 dawki maksymalnej

Badanie rakotwórczości Liczba zwierząt 100 szczurów (po 50 każdej płci) dla każdego poziomu dawki 100 myszy (po 50 każdej płci) dla każdego poziomu dawki Czas podawania substancji w paszy Szczury – 2 lata Myszy – 1,5 roku Psy, świnie – 5-7 lat

Badanie rakotwórczości Obserwacje: Spożycie paszy, wody i masa ciała – jak w toksyczności przewlekłej Stan zwierząt – każdego dnia, dzień śmierci zwierząt padłych i jej przyczynę na podstawie sekcji Na końcu – sekcja pozostałych zwierząt i badania makroskopowe, waży się: wątrobę, nerki, śledzionę, nadnercza, węzły chłonne, tarczycę, jajniki, mózg, przysadkę, jądra, płuca, pęcherz

Badanie rakotwórczości Wykonuje się rozmaz krwi i szpiku Badana mikroskopowe 7 pierwszych narządów ale bada się także te narządy, w których obserwowano zmiany w czasie sekcji

Badanie rakotwórczości Interpretacja: Oparta jest na liczbie się guzów i czasie ich pojawienia się w tych samych narządach zwierząt badanych i kontrolnych oraz czasie przeżycia zwierząt Uwzględnia się guzy złośliwe i niezłośliwe

Badanie zdolności rozrodczej i wpływu na potomstwo Ma na celu zbadanie możliwego wpływu badanej substancji na płodność i laktację oraz pozwala na zaobserwowanie zmian genetycznych Grupy zwierząt i dawki – jak przy toksyczności przewlekłej

Badanie zdolności rozrodczej i wpływu na potomstwo Obserwacje: % zapłodnienia Okres ciąży (krótszy, dłuższy) Liczba młodych w każdym miocie Masa ciała młodych Śmiertelność noworodków Odchylenia od stanu prawidłowego w 4, 12 i 21 dniu życia Badania histopatologiczne narządów od 10 samic i 10 samców z każdej grupy

Badanie teratogenności Zwierzęta: Szczury, chomiki, króliki (zalecane samice po raz pierwszy zapładniane), po 20 zwierząt dla każdej dawki Młode, zdrowe, dojrzałe fizycznie i płciowo Badaną substancję podaje się w paszy ciężarnym samicom w okresie organogenezy (szczury – 6-15 dzień ciąży, chomiki – 6-10 dzień, króliki dzień- 6-18)

Badanie teratogenności Dawkowanie substancji zależy od szybkości jej wydalania z organizmu oraz jej działania embrio- i cytotoksycznego

Badanie teratogenności Wymagane są co najmniej 3 poziomy dawek, np. Grupa kontrolna Grupa otrzymująca dawkę małą – 1/250 DL50 Grupa otrzymująca dawkę pośrednią – 1/100 DL50 Grupa otrzymująca dawkę dużą – 1/50 DL50

Badanie teratogenności Obserwacje: Spożycie paszy i wody oraz kontrola masy ciała w określonych dla danego zwierzęcia dniach ciąży Płody wyjmuje się przez cesarskie cięcie u szczurów na 1 dzień przed porodem, u królików – 2 dni

Badanie teratogenności Ocenia się: Liczbę płodów po prawej i lewej stronie macicy Liczbę resorpcji Liczbę ciałek żółtych Masę płodów z łożyskiem i bez Długość płodu z ogonem, długość ogona Płeć Deformacje makroskopowe Deformacje szkieletu Liczbę krwiaków

Badanie teratogenności U 20% samic w grupie nie wykonuje się cesarskiego cięcia Płody normalnie urodzone obserwuje się przez 2-3 miesiące aby wychwycić wady pojawiające się w czasie rozwoju Wybrane losowo zwierzęta kojarzy się w celu otrzymania II generacji Młode tej generacji usypia się po 21 dniach i bada ich rozwój

Badanie mutagenności Działanie mutagenne jest ściśle związane z działaniem rakotwórczym Ok. 90% związków rakotwórczych wykazuje działanie mutagenne w prostych testach bakteryjnych

Badanie mutagenności Stosuje się testy bakteryjne Amesa Pozwalają wykryć mutacje punktowe: mikrojąderkowy – umożliwia wykrycie uszkodzeń w chromosomach test reperacji DNA

Badanie działania alergicznego- kontaktowego Testy na zwierzętach Badania z udziałem ludzi – testy w klinikach dermatologicznych Dotyczą kosmetyków i środków piorących

Ekstrapolacja wyników badań Biorąc pod uwagę wyniki wszystkich badań na zwierzętach oraz ustaloną w badaniach toksyczności przewlekłej dawkę NOAEL – ustala się dawkę ADI dla człowieka ADI = NOAEL : 100 (najczęściej ale może to być także :10 lub :1000)

Badania epidemiologiczne Kiedy wiadomo, że zanieczyszczenie wnikające do organizmu ma potencjalne właściwości rakotwórcze jest możliwe: Retrospektywne badanie epidemiologiczne jeżeli wykaże ono zależność między ekspozycją na czynnik rakotwórczy i zachorowalnością oraz śmiertelnością – czynnik może zostać uznany za rakotwórczy dla ludzi