WPŁYW pH NA ANTYOKSYDACYJNE DZIAŁANIE WYBRANYCH POLIFENOLI W UKŁADACH HETEROGENICZNYCH Aleksandra Gaik Małgorzata Musialik (opiekun pracy) Grzegorz Litwinienko (kierownik pracy) praca wykonana w Pracowni Fizykochemicznych Podstaw Technologii Chemicznej Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego ul. Pasteura 1, 02-093 Warszawa Tabela 1. pKa dla fenoli badanych w pracy. OGÓLNY MECHANIZM AUTOOKSYDACJI inicjacja: tworzenie rodników L• propagacja: L• + O2 LOO• LOO• + LH LOOH + L• terminacja: L• LO• LOO• rekombinacja z utworzeniem nierodnikowych produktów FENOLOWE ANTYOKSYDANTY INTERWENTYWNE (chain-breaking antioxidants) Reagują z rodnikami nadtlenkowymi tworząc stabilny rodnik oraz wodoronadtlenek: PhOH + LOO• PhO• + LOOH i hamują reakcję propagacji: LOO• + LH LOOH + L• ZWIĄZEK pKa1 pKa2 pKa3 PMHC1 11,92 BHT2 12,2 DTBCat3 > 9,5 >14 7,8-dihydroksyflawon4 7,20 10,92 kurkumina5 8,54 9,30 10,69 kwercytyna6 6,74 9,02 11,0 AUTOOKSYDACJA - proces wolnorodnikowy przebiegający według mechanizmu łańcuchowego, prowadzący do szeregu patologicznych zmian w komórkach i stanowiący molekularną podstawę procesów starzenia. Przyczynia się do rozwoju wielu ciężkich schorzeń takich jak choroby serca, miażdżyca, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i nowotwory. MATERIAŁY I METODY Pomiary zostały wykonane dla linolanu metylu i estru metylowego oleju słonecznikowego w roztworach heterogenicznych (emulsje estru nienasyconego kwasu tłuszczowego zdyspergowane w wodzie przy użyciu surfaktanta anionowego dodecylosulfonianu sodu, SDS) oraz jego mieszanin z następującymi fenolami: Stężenia fenoli wynosiły od 0.008 do 0.065 mM, a inicjatora 2,2’-azobis(2-amidynopropanu) (ABAP) od 10.0 do 40.0 mM. Pomiary szybkości pochłaniania tlenu w procesie inicjowanej autooksydacji emulsji lipidowych prowadzono za pomocą elektrody tlenowej Clarka (Yellow Springs Instruments 5300A Biological Oxygen Monitor) w temperaturze 37.0oC. 1 Steenken, S.; Neta, P. J. Phys. Chem. 1982, 86, 3661-3667. 2 Serjeant, E. P.; Dempsey, B., Ionisation constants of organic acids in aqueous solution, Eds., IUPAC Chemical Data Series, No. 23, Pergamon Press: Oxford, UK, 1979. 3 Slabbert N.P., Tetrahedron, 1977, 33, 821-824. Pergamon Press. 4 Zera S., praca magisterska „Wyznaczanie wartości pKa dla wybranych polifenoli w układzie woda / metanol”. 5 Litwinienko, G.; Ingold, K. U. J. Org. Chem. 2004, 69, 5888-5896. 6 Jovanovic, S. V., Steenken, S., Tosic, M., Marjanovic, B., Simic., M. G. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 4846-4851. REZULTATY 2,2,5,7,8-pentametylo-6-hydroksychroman (PMHC) 2,6-di-tert-butylo-4-metylofenol (BHT) 3,5-di-tert-butylokatechol (DTBCat) PODSUMOWANIE Elektroda tlenowa typu Clarka została z powodzeniem zastosowana do pomiarów postępu inhibitowanej autooksydacji lipidów w układach emulsyjnych. W takich układach pomiarowych można wyróżnić dwa obszary kinetyczne. Najpierw następuje powolne pochłanianie tlenu podczas tzw. okresu indukcji, co jest spowodowane inhibicyjnym wpływem antyoksydanta. Po wyczerpaniu antyoksydanta szybkość pochłaniania tlenu gwałtownie wzrasta. Długość okresu indukcji jest miarą aktywności antyoksydanta. Dla wszystkich badanych pochodnych fenolowych zaobserwowano wydłużenie czasu indukcji w miarę wzrostu pH od 4 do 7. Jest to spowodowane większym udziałem formy zdeprotonowanej antyoksydanta w reakcji z rodnikami nadtlenkowymi: PhOH  PhO + H+ PhO + ROO  PhO + ROO ROO + H+  ROOH Ponieważ przeniesienie elektronu jest procesem o wiele szybszym od przeniesienia atomu wodoru, inhibicja autooksydacji jest bardziej efektywna w pH 7 niż w pH 4. W osobnych badaniach wykazano, że pH nie wpływa na szybkość inicjowania autooksydacji. W przedziale pH od 7 do 9 obserwowano dalszy wzrost aktywności PMHC, BHT i kurkuminy, natomiast pochodne katecholowe: 3,5-di-tert-butylokatechol, 7,8-dihydroksyflawon i kwercetyna wykazały spadek zdolności inhibicyjnej dla pH 8 i 9. Obniżenie aktywności inhibicyjnej jest spowodowane tym, że w formie zdysocjowanej katechole reagują bezpośrednio z tlenem tworząc orto-chinony oraz rodniki wodoronadtlenkowe lub anionorodniki ponadtlenkowe: Wykres 2. Zmiany stężenia tlenu podczas autooksydacji linolanu metylu w obecnosci 0.0345mM BHT w 37.0 oC w zakresie pH 4-9. Wykres 3. Zmiany stężenia tlenu podczas autooksydacji linolanu metylu w obecnosci 0.0270 mM DTBCat w 37.0 oC w zakresie pH 4-9. Wykres 1. Zmiany stężenia tlenu podczas autooksydacji linolanu metylu w obecnosci 0.0086mM PMHC w 37.0 oC w zakresie pH 4-9. 1,7-bis(4-hydroksy-3-metoksyfenylo)- 1,6-n-heptadienylo-3,5-dion (kurkumina) 7,8-dihydroksyflawon 3,3’,4’,5,7-pentahydroksyflawon (kwercetyna) ELEKTRODA TLENOWA CLARKA BUDOWA DZIAŁANIE ZASTOSOWANIE biologia medycyna ochrona środowiska przemysł spożywczy Elektroda zbudowana jest z katody platynowej i anody srebrnej. Elektrolitem jest nasycony roztwór chlorku potasu. Teflonowa membrana jest nieprzepuszczalna dla roztworu, ale umożliwia dyfuzję tlenu do przestrzeni elektrodowej. Tlen ulega redukcji na katodzie według równania: O2 + 2H2O + 4e- 4OH¯ Równocześnie na anodzie przebiega reakcja utleniania metalicznego srebra według równania: 4Ag + 4Cl¯ 4AgCl + 4e- Wykres 4. Zmiany stężenia tlenu podczas autooksydacji estru metylowego oleju słonecznikowego przeprowadzonej w obecnosci 0.0651mM (adla pH9.0 0.0326mM) kurkuminy w 37.0 oC w zakresie pH 4-9. Wykres 5. Zmiany stężenia tlenu podczas autooksydacji linolanu metylu w obecnosci 0.0260mM 7,8-dihydroksyflawonu w 37.0 oC w zakresie pH 4-9. Wykres 6. Zmiany stężenia tlenu podczas autooksydacji linolanu metylu w obecnosci 0.0201mM kwercetyny w 37.0 oC w zakresie pH 4-9. Wykres 7 (a,b). Zależność czasów indukcji od pH dla autooksydacji lipidów inhibitowanej wybranymi fenolami w temperaturze 37.0oC. a b Tabela 2. Czasy indukcji dla autooksydacji lipidów inhibitowanej wybranymi fenolami w różnych pH w temperaturze 37.0oC. ZWIĄZKI C [mM] CZAS INDUKCJI [min] pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 PMHC 0.0086 29.8 48.5 69.2 55.5 65.5 62.1 BHT 0.0345 73.6 74.3 74.2 75.8 89.5 94.8 DTBCat 0.0270 14.0 104.0 106.3 32.6 30.2 kurkumina 0.0651 31.3 54.0 49.6 51.8 50.0 50.0a 7,8-dihydroksyflawon 0.0260 b 37.5 172.5 136.6 kwercetyna 0.0201 35.9 49.3 86.3 18.3 15.6 15.0 Elektroda tlenowa Clarka (5300A Biological Oxygen Monitor firmy Yellow Springs Instruments), komora pomiarowa oraz urządzenia przekazujące sygnał do komputera. a [PhOH]=0.0326 mM; b czasów indukcji w pomiarach nie uzyskano LITERATURA CYTOWANA [1] a) G. Litwinienko, K. U. Ingold, J. Org. Chem. 2003, 68, 3433-3438. b) G. Litwinienko, K. U. Ingold, J. Org. Chem. 2004, 69, 5888-5896. c) G. Litwinienko, K. U. Ingold, J. Org. Chem. 2005, 70, 8982-8990. [2] M. Musialik, G. Litwinienko, Org. Letters 2005, 7, 4951-4954. [3] G. Litwinienko, K. U. Ingold, Acc. Chem. Res. 2007, 40, 222-230. [4] M. A. Lessler, Adaptation of Polarographic Oxygen Sensors for Biochemical Assay, Methods of Biochemical Analysis, vol. 28 and vol. 17