Biomonitoring stanu środowiska

Biomonitoring Bioindykatory – organizmy używane jako wskaźniki stanu środowiska Biomarkery – składniki materii ożywionej (najczęściej biomakromolekuły) używane jako elementy układów analizujących stan środowiska Biosensory – wyizolowane biomarkery wbudowane w układy pomiarowe

Przykłady bioindykatorów Organizm Polutant Charakter Dżdżownica Pszczoła miodna Porosty Mchy Płastuga zimnica (Limanda limanda) Krab semaforowy (Heloecius cordiformis) Małże 2,4,6-trinitrotoluen Metale Zanieczyszczenia powietrza DDT Metale ciężkie Toksyczność Ekstrahowane z pszczół i z miodu Parametry fizjologiczne Zawartość metali Wady rozwojowe Ekstrahowane z organów Zawartość w tkankach miękkich

Biomarkery genetyczne Białka luminescencyjne Lucyferaza bakteryjna – gen luxAB Lucyferaza eukariotyczna – gen luc Zielone białko fluoryzujace (GFP) z meduzy Aqorea victoria – gen gfp Przykład zastosowania: Szczep E. coli, w którym gen luxAB z Vibrio harveyi znajduje się pod kontrolą promotora alkB z Pseudomonas oleovorans. Komórki odpowiadają świeceniem na obecność alkanów.

Testy toksyczności Przykłady organizmów wykorzystywanych w testach toksyczności Bakterie: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Vibrio Grzyby: Candida, Saccharomyces, Penicillium, Aspergillus Glony: Chlorella, Scenedesmus, Selenastrum Pierwotniaki: Spirostomum, Vorticella, Paramaecium Wrotki: Brachionus Skorupiaki: Daphnia, Gammarus, Artemia, Mysis, Asellus, Hyalella Owady: Ephemerella, Hydropsyche, Chironomus Mięczaki: Physa acuta, Planorbarius coernus, Dreissena polymorpha Ryby: Lebistes reticulatus (Gupik pawie oczko), Brachydanio rerio (Danio pręgowany) ), także innych 150 gatunków

Testy toksyczności Testy z wykorzystaniem roślin i glonów Poziom troficzny Typ Przykłady 1 2 3 4 5 Pierwotni producenci Konsumenci I rzędu Konsumenci II rzędu, mięsożercy Konsumenci III rzędu Konsumenci IV rzędu ptaki drapieżne Chlorella vulgaris, Selenastrum capricornutum, Senendesus quadricauda, Lemna spp. Rozwielitki (Daphnia spp., krewetki (Artemia salina) Brak Ryby, m.in.: płoć, pstrąg tęczowy gołąb, przepiórka, bażant pustułka, myszołów Kolorem czerwonym zaznaczono organizmy najpowszechniej wykorzystywane w testach. Testy polegają na podaniu hodowli glonów działaniu związku przez 3 – 4 dni i określeniu wartości EC50. W przypadku organizmów poziomu 2 ekspozycja trwa 24 h.

Bakterie świecące Morfologia Vibrio fischeri Kolonie bakterii Photobacterium luciferum Wzrost Vibrio fischeri na podłożu agarowym BOSS, Z lewej – zdjęcie przy oświetleniu normalnym; z prawej – zdjęcie wykonane w ciemności przy czasie ekspozycji 40 s.

Na podstawie materiałów z National Centre for Biotechnology Education. Autor rysunków: Paul Stevens

Testy toksyczności System BIOTOX do określania toksyczności związków chemicznych BIOTOX  - test wykorzystujący bakterie luminescencyjne Vibrio fischeri. Reakcją testową jest obniżenie luminescencji (świecenia) bakterii. Czas inkubacji jest wyjątkowo krótki – tylko 15 minut. Test wykonuje się wg standardowej procedury producenta, przy użyciu analizatora i liofilizowanych bakterii.

Daphtoxkit F™ magna - Toxkit wykorzystujący skorupiaka Daphnia magna. Spirotox - test wykorzystujący pierwotniaki Spirostomum ambiguum. W teście tym obserwuje się dwa rodzaje reakcji testowych: deformacje komórki oraz śmierć komórki. Na podstawie wyników obliczane są dwie wartości: EC50 – stężenie wywołujące 50% przyżyciową reakcję testową oraz LC50 – stężenie wywołujące 50% śmietelną reakcję testową. Standardowy czas trwania testu (inkubacji) wynosi 24 godziny, chociaż w wielu przypadkach reakcje testowe występują już po 2 godzinach. Protoxkit F™ - Toxkit wykorzystujący pierwotniaka Tetrahymena termophila. Reakcją testową jest inhibicja wzrostu pierwotniaków. Jej miarą jest spadek gęstości pokarmu (bakterii) mierzony spektrofotometrycznie. Jest to test chroniczny pozwalający w ciągu jedynie 24 godzin ocenić wpływ badanej próbki na kilka pokoleń pierwotniaków. Rotoxkit F™ - Toxkit wykorzystujący wrotka Brachionus calyciflorus. Reakcją testową jest śmierć organizmu. Daphtoxkit F™ magna - Toxkit wykorzystujący skorupiaka Daphnia magna. Standardowy test toksyczności przeprowadzony wg zaleceń OECD. Reakcją testową jest zahamowanie ruchu skorupiaków (immobilizacja) obserwowana po 24 i 48 godzinach inkubacji. Test wykonuje się przy zastosowaniu dafni świeżo wylęgłych z jaj przetrwalnych (Creasel, Deinze, Belgia). Procedura ta umożliwia eliminację ciągłej hodowli organizmów. Thamnotoxkit F™ - Toxkit wykorzystujący skorupiaka Thamnocephalus platyurus. Reakcją testową jest śmierć skorupiaków. Test wykonuje się przy zastosowaniu organizmów świeżo wylęgłych z jaj przetrwalnych (Creasel, Deinze, Belgia). Test ten polecany jest jako tańsza alternatywa dla testu Daphnia. W wielu przypadkach test ten jest bardziej czuły na obecność substancji toksycznych niż standardowy test Daphnia.

Testy genotoksyczności (mutagenności Test Amesa a/ Płytka kontrolna; b-d/ płytki z krążkami zawierającymi związek mutagenny. Stężenie związku było najwyższe na płytce b, a najniższe na płytce d. Wszystkie płytki zostały zaszczepione identyczną liczbą komórek Salmonella typhimurium (His-).

Porównanie odpowiedzi różnych biomarkerów i bioindykatorów na pentachlorofenol Organizm Typ Indykator Czas ekspozycji (h) EC50 (M) Chlorella vulgaris Daphnia magna Allium cepa Sunfish Płoć Pstrąg tęczowy Vibrio fischeri Komórki linii RTG-2 Komórki linii Vero Mikroglony Skorupiak Roślina Ryba Bakteria Małpa Hamowanie wzrostu Immobilizacja Indeks mitotyczny Śmiertelność Luminescencja Pobieranie barwnika Redukcja MTT 24 96 48 1 59 2,2 10 0,2 1,76 0,35 1,9 90 34 38

Biosensory Wyizolowane biomarkery wbudowane w układy pomiarowe. Układ pomiarowy składa się z biosensora, transduktora przetwarzającego sygnał biologiczny na sygnał elektryczny i integratora/rejestratora

Biosensory Czynnik mierzony Biosensor Transduktor BZT5 Atrazyna, estron, izoproturon Fenol Azotany Fosforany Metale ciężkie Herbicydy Pestycydy Immobilizowane komórki bakeryjne Photobacterium phosphoroeum Przeciwciała Peroksydaza z chrzanu Agrobacterium radiobacter Reduktaza azotanowa z Alcaligenes faecalis Oksydaza pirogronianowa Fitochelatyna Immobilizowane komórki Chlorella vulgaris Esteraza acetylocholinowa Elektroda tlenowa Fotodioda Fotopowielacz Amperometr Konduktometr Czujnik optyczny

Biosensory Porównanie konstrukcji elektrody tlenowej i biosensora BZT5. W biosensorze komórki drobnoustroju są immobilizowane pomiędzy przepuszczalną dla gazów (w tym tlenu) membraną teflonową a przepuszczalna dla składników środowiska membrana zewnętrzną. Im większa zawartość metabolizowalnych składników w środowisku, tym większa aktywność metaboliczna komórek, a co za tym idzie, szybsza redukcja poziomu tlenu.