Robert Delicat Kamil Cymański. Biomonitoring - regularne, czasowe i przestrzenne obserwacje w celu gromadzenie danych o zmianach zachodzących w środowisku,

Prezentacja na temat: "Robert Delicat Kamil Cymański. Biomonitoring - regularne, czasowe i przestrzenne obserwacje w celu gromadzenie danych o zmianach zachodzących w środowisku,"— Zapis prezentacji:

1 Robert Delicat Kamil Cymański

2 Biomonitoring - regularne, czasowe i przestrzenne obserwacje w celu gromadzenie danych o zmianach zachodzących w środowisku, najczęściej do określenia rozmiarów i nasilenia zanieczyszczeń. Można je realizować w dwojaki sposób:  w oparciu o typowe badania analityczne próbek materii ożywionej (bioty)  poprzez obserwacje biowskaźników (odpowiednich organizmów roślinnych i zwierzęcych)

3 Bioanalityka – jest związana z wykorzystaniem substancji aktywnych biologicznie jako receptorów określonych zanieczyszczeń. Ze względu na sposób wykorzystania składnika biologicznego możemy mówić o :  Bioczujniki - gdy składnik aktywny biologicznie (bakterie, wirusy, enzymy itd.) stanowi cześć aktywna danego czujnika (np. elektrody potencjometryczne)  Biotesty - gdy materiał biologiczny stanowi „oryginalne” urządzenie kontrolno -pomiarowe

4 Bioindykacja jest metodą wykorzystującą jako wskaźnik organizm żywy, którego reakcja może być podstawą oceny ogólnej aktywności biologicznej badanego układu. Opiera się na systemie wskaźników biologicznych (bioindykatorów) i ich zróżnicowanej i specyficznej relacji na określone czynniki środowiska Środowiskowy- kontynuuje się badania wpływu czystych związków oraz ścieków na środowisko przyrodnicze. Wybierane są organizmy charakterystyczne dla danych biocenoz, obok pojedyńczych gatunków stosuje się całe ekosystemy (naturalne i sztucznie konstruowane stawy, strumienie i ekosystemy lądowe). Drugi kierunek bioindykacji zajmuje się bezpośrednio środowiskiem człowieka. Organizmy testowe wybierane są pod kątem szczególnej wrażliwości na związki chemiczne szkodliwe dla człowieka. Stanowią one rodzaj alarmu ostrzegającego przed skażeniem.

5 CELE BIOINDYKACJI określenie charakterystyki toksykologicznej substancji biologicznie aktywnej, bądź jej formy użytkowej. ocena stanu ekosystemów, do ustalenia pojemności ekosystemów wobec toksyn, a także do oceny interakcji między toksynami oraz między toksyną a środowiskiem. ochrona wodociągów oraz biologicznych oczyszczalni ścieków poprzez system reakcji alarmowej.

6 BIOINDYKATOR organizm żywy występujący w ściśle określonych warunkach środowiska, służący jako wskaźnik, np. zanieczyszczenia powietrza, wody lub substancji zawartych w glebie

7 Nowoczesne testy bioindykacyjne Organizm testowy musi odpowiadać wielu surowym wymaganiom dotyczącym m. in. ciągłej dostępności i jednorodności genetycznej. Ciągłą dostępność bioindykatorów można osiągnąć dwoma sposobami. Po pierwsze, można prowadzić stałą hodowlę organizmów testowych. Po drugie, można kupować bioindykatory ze sprawdzonych źródeł. Obecnie wprowadzane są gotowe testy sprzedawane w postaci pakietów pozwalające na ocenę toksyczności badanych prób w krótkim czasie. Zawierają one formy kryptobiotyczne bioindykatorów (pochodzące ze standardowej hodowli), które mogą być długo przechowywane i w razie potrzeby w krótkim czasie przygotowane do testu.

8 Ocena efektów toksycznych 3 zasadnicze problemy:  ocena ryzyka – prawdopodobieństwo wystąpienia negatywnego oddziaływania danego czynnika na żywy organizm  określenie jak wysoka jest toksyczności poprzez wyznaczenie dawki wywołującej efekt toksyczny  próba wykrycia odległych skutków ekspozycji organizm na czynniki toksyczne takie jak: np. mutageny, kancerogeny, czy też związki wykazujące właściwości taratogenne i/lub embriotoksyczne.

9 Toksyczność ostra LD 50 (Lethal dose) – dawka wywołująca po określonym czasie śmierć 50% osobników badanej populacji LC 50 (Lethal Concentration) – stężenie śmiertelne danje substancji w wodzie, glebie lub powietrzu Określenie toksyczności ostrej jest zwykle wstępnym etapem oceny oddziaływań danej substancji na organizm i pozwala ukierunkować dalsze badania toksyczności.

10 Badania ekotoksykologiczne można prowadzić w dwojaki sposób: - poprzez badania epidemiologiczne, polegające na obserwacji pewnej populacji ludzkiej narażonej na określone zanieczyszczenia środowiska, co umożliwia bezpośrednie oszacowanie ryzyka narażenia człowieka - poprzez stosowanie metod laboratoryjnych prowadzonych z wykorzystaniem różnych modeli doświadczalnych i podjęcie próby wykorzystania uzyskanych wyników do oceny wielkości narażenia człowieka W zależności od stosowanego modelu, metody laboratoryjne dotyczyć mogą badać toksyczności w stosunku do: - całego organizmu - wybranego narządu - hodowli komórek - reakcji enzymatycznych

11 Na podstawie zależności: dawka – odpowiedź wyznaczyć można wartości wskaźników bądące ilościową miarą toksyczności badanej substancji. Siłą toksycznego oddziaływania na organizmy żywe określają takie wskaźniki jak EC25 lub EC50 (ang.Effective Concentration) oraz ED25 lub ED50 (ang. Effective Dose), czyli stężenie danej toksyny w środowisku lub jej dawka, która wywołuje określony efekt biologiczny w wysokości 25% lub 50% jego maksymalnej wartości. Innym stosowanym wskaźnikiem jest wskaźnik IC50 (ang. Inhibition Concentration) – czyli stężenie czynnika toksycznego w środowisku, które powoduje osłabienie (zahamowanie) o połowę danego procesu, np. wzrostu.

12 W przypadku toksyczności ostrej występuje takie oddziaływanie danej substancji,które zaburza procesy biologiczne w takim stopniu, iż nastupuje śmierć. Miarą takiego efektu jest dawka śmiertelna - LD50 (ang. Lethal Dose), czyli dawka wywołująca po określonym czasie śmierć 50% osobników badanej populacji. Często stosuje się też parametr określajcy stężenie śmiertelne danej substancji w wodzie, glebie lub powietrzu – LC50 (ang. Lethal Concentration). Określenie toksyczności ostrej jest zwykle wstępnym etapem oceny oddziaływania danej substancji na organizm i pozwala ukierunkować dalsze badania toksyczności.

13 Toksyczność przewlekła (chroniczna)  NOEL / NOEC – najwyższa dawka/stężenie substancji toksycznej, przy których nie obserwuje się niekorzystnego efektu jej działania (No Observed Effect Level/Concentration)  LOEL / LOEC – najniższa dawka lub stężenie przy których zaobserwowano pierwsze niekorzystne zmiany (Lowest Observed Effect Level/Concentration)  NOAEL – najwyższa dawka lub stężenie substancji, przy której w trakcie badań nie jest wykrywalna szkodliwa zmiana (No Observed Adverse Effect Level)  LOAEL –najniższa dawka lub stężenie substancji, przy której w trakcie badań zauważa się szkodliwą zmianę (Lowest Observed Adverse Effect Level)

14 BIOTESTY  eksperymentalna próba biologiczna, której celem jest wykazanie obecności substancji toksycznych w środowisku albo poznaniu jej szkodliwości poprzez ilościowe oszacowanie jej wpływu na żywy organizm (na postawie porównania z próbą kontrolną)

15 3 główne sposoby przeprowadzania biotestu  1A – testy toksyczności realizowane w laboratorium – substancja toksyczna wprowadzana do czystej wody lub osadu – źródło informacji na temat toksyczności danej substancji w kontrolowanych warunkach wzorcowanie biotestu

16 3 główne sposoby przeprowadzania biotestu  1B – testy prowadzone w laboratorium na bazie pobranych próbek rzeczywistych toksyczność próbek porównywana z toksycznością próbek wzorcowych  2 – testy przeprowadzane in situ, z wykorzystaniem populacji organizmów żyjących w warunkach naturalnych

17 Biotesty mogą być realizowane w warunkach:  Statycznych – badana woda nie podlega wymianie w trakcie trwania testu  Półstatycznych – wymiana medium następuje w określonych odstępach czasu (np..testy z wykorzystaniem skorupiaka Daphnia magna)  Dynamicznych – przy stałej wymianie wody, podczas testów wykonywanych w mezosystemach, in situ (głównie z wykorzystaniem ryb).

18 Ze względu na organizmy stanowiące element aktywny biotesty dzielimy na :  Z udziałem roślin  Z udziałem bakterii  Z udziałem zwierząt

19 Czułość biotestu NOEC x W = ------------ NOEC średni gdzie: NOEC x – wartość dla jednego biotestu NOEC średni- wartość średnia parametru dla całej baterii Wybór odpowiedniego biotestu do badań toksyczności zależy od rodzaju wymaganych informacji, stanu oraz własności fizycznych i chemicznych analizowanej próbki, rodzaju badanej substancji toksycznej, a także od wrażliwości gatunku testowanego organizmu.

20 Czułość biotestu W <1 oznacza, że organizmy stosowane w tym pojedynczym bioteście charakteryzuje wysoka względna wrażliwość w stosunku do badanej substancji toksycznej.

21 Biotesty bakteryjne Bioluminescencja morskich bakterii Vibrio fischeri znalazła szerokie zastosowanie w testach toksyczności. Biotesty takie stanowią użyteczne narzędzie wykorzystywane do oceny stopnia zanieczyszczenia wód, osadów dennych. Toksyczność każdego z tych ekosystemów jest określana na podstawie pomiaru bioluminescencji bakterii, które w trakcie swoich funkcji życiowych emitują światło. Pomiaru luminescencji dokonuje się przed i po inkubacji zawiesiny bakteryjnej z badaną próbką.

22 Biotesty bakteryjne  Mechanizm toksycznego działania poszczególnych związków chemicznych są odmienne i złożone.  Toksyczność może wynikać z: odzdziaływania toksyny z receptorami komórkowymi przerwania funkcji membrany komórkowej reakcji chemicznych z elementami składowymi komórki hamowania / współzawodnictwa systemów enzymatycznych

23 Biotesty bakteryjne Obecnie do najczęściej stosowanych opartych na wykorzystaniu zjawiska bioluminescencji bakterii Vibrio fischeri, należy: ToxAlert 10 ToxAlert 100 Microtox LUMIStox

24 Fitotesty (wykorzystanie roślin) Czynniki aktywne : glony (zielenice, sinice, okrzemki) rzęsa wodna ukorzenione makrofity ( roślina i jej nasiona) Reprezentują organizmy o szczególnym znaczeniu dla swoich siedlisk naturalnych ponieważ : dostarczają tlen zapewniają obieg materii organicznej kontrolują jakość wody oraz równowagę gleb i osadów dennych zapewniają pożywienie, schronienie, siedlisko życia innym organizmom (insektom, bezkręgowcom, rybom, płazom, ptakom i ssakom) Zmiany zachodzące w roślinach mogą bezpośrednio wpływać na strukturę i funkcjonalność całego ekosystemu

25 Zastosowanie alg : zdolność akumulacji związków chemicznych ( wchłanianie metali: Mn 2+, Mo 2+, Ni 2+, V 5+ ) stanowią znaczną immobilną część biomasy środowiska wodnego Wybór gatunku glonu do danego testu zależy od : dostępności wymagań hodowli łatwości użycia Na podstawie tych kryteriów zaleca się stosowanie mikroalg ( mikrobiotesty). Najczęściej testowane należą do gatunku zielenic. Są to: - Selenastrum capricornum - Scenedesmus quadricanda - S. subspicatus Sinice i okrzemki są rzadziej stosowane ze względu na ich powolny wzrost i wymagające warunki hodowli

26 Testy z zastosowaniem mikroalg : Szybka metoda pomiaru ilości komórek w przepływającym medium, umożliwiając pominięcie ograniczeń tradycyjnej metody takich jak : wysoka, niemożliwa do osiągnięcia w warunkach naturalnych gęstość komórkowa, co prowadzi do starzenia się gatunku brak technik umożliwiających liczenie komórek i jednoznaczne rozróżnienie pomiędzy żyjącymi i martwymi, a także zawieszona materią niemożność wyznaczenia w czasie więcej, niż jednego parametru charakterystycznego dla gatunku niemożność uzyskania informacji o mechanizmie toksycznego działania zanieczyszczeń Cechy mikroalg przydatne w analizie : Budowa ( pojedyncze komorki ) zawartosc fotosynteycznego barwnika (chlorofil a, wzbudzany pod wpływem światła niebieskiego) I.Cytometria przepływowa

27 II.Immobilizacja Unieruchomienie materiału biologicznego na specjalnym podłożu zapobiega wymyciu komórek spożyciu przez zwierzęta roślinożerne. Tak przygotowane hodowle utrzymują stałość procesów oddychania i fotosyntezy, a po 12 miesiącach przechowywania ich w ciemności i temperaturze 4 st.C. Powracają do normalnego wzrostu. Dotychczas immobilizowane komórki alg stosowano głównie w procesach oczyszczania wód ściekowych z metali ciężkich, związków azotu i fosforu. Ostatnio rozpoczęto badania nad ich wykorzystaniem do kontroli jakości wody stosowanej podczas hodowli ryb.

28 Testy z zastosowaniem roślin naczyniowych Przeprowadza się głownie w biotestach do pestycydów wielopierścieniowych węglowodorów metali ciężkich Makrofity :niezwykle rzadko stosowane w testach toksyczności Najczęściej stosuje sie rzęsę wodną jako gatunek reprezentatywny (Lemna minor, Lemna gibba) jest ona swobodnie pływająca, nie zakorzeniona w podłożu Cechy decydujące o wykorzystaniu jako materiału biologicznego: małe rozmiary łatwość hodowli krótki czas rozmnażania (dwukrotnie wzrost następuje w przeciągu 1-4- dni) Badania licznej grupy gatunków alg i makrofitów w stosunku do herbicydów świadczą o ich porównywalnej wrażliwości.

29 RodzinaGatunek Parametr mierzony, wielkość oznaczenia Czas trwania testu Zastosowanie Liczba powtórze ń zielenice Selenastrum capricornutu m Stężenie chlorofilu, EC 50 3 dni Porównanie selektywności i wrażliwości rożnych gatunków alg w stosunku do herbicydów i związków nieorganicznych metali 6 Hamowanie wzrostu, EC 50 3 dni Wpływ działalności rolniczej na jakość wody rzecznej (Japonia) 1

30 Biotesty zwierzęce Zdecydowanie częściej stosowane niż testy roślinne 90% wszystkich przeprowadzonych testów to zwierzęce). Wg danych zawartych w bazie AQUIRE ( aquatic toxicity information retriewal ) wśród 20 najczęściej opisywanych organizmów testowych, zielenica jako pierwszy organizm roślinny zajmuje 13 miejsce ! Względna wrażliwość roślin i zwierząt zależy od warunków środowiska : materii organicznej pH temperatury twardości obecności ligandów wzajemnych oddziaływań substancji toksycznych

31 Czynniki wpływające na działanie biotestów : rodzaj wymaganej informacji stan oraz właściwości fizyczne i chemiczne badanej próbki rodzaj badanej substancji toksycznej wrażliwość gatunku testowanego organizmu Baterie (zespoły) biotestów metoda zmniejsza ryzyko popełnienia błędu ujemnego (niedoszacowania) wyniku toksyczności badanej substancji w odniesieniu do całego ekosystemu wykorzystanie organizmów o różnej wrażliwości i reprezentujących różne poziomy troficzne stosowane do badan skompilowanych mieszanin związków o rożnych właściwościach

32 Mikrobiotesty działają w oparciu o organizmy jednokomórkowe bądź małe wielokomórkowce, które w wyniku kontaktu z próbka ciekła daja specyficzna odpowiedz Stosowane z reguly w postacji baterii biotestow Ze względu na : duża powierzchnia właściwa bezpośredni kontakt błony komórkowej z badanym medium krótki czas życia pojedynczego pokolenia mikroorganizmy wykazuja wieksza wrazliwosc w stosunku do substancji toksycznych, niż gatunki bezkregowcow lub ryby Zalety : eliminacja konieczności utrzymania hodowli niski koszt przeprowadzania analizy pojedynczej próbki możliwość jednoczesnego badania kilku próbek krótki czas odpowiedzi mała objętość badanej próbki niewielka przestrzeń zajmowana w laboratorium przez odpowiedni zestaw możliwość zastosowania zestawu w terenie

33 Przebieg :  Organizmy do testów dostarczone są do laboratorium w formie kryptobiotycznej : wrotki w formie cyst skorupiaki – jaj przetrwalnikowych glony jako komórki unieruchomione na odpowiednim nośniku - Są one zabezpieczone przed rozwojem specjalnym roztworem - Formy te mogą być przechowywane w lodówce przez kilka miesięcy  Przed rozpoczęciem testu umieszcza się cysty w wodzie  Pod wpływem silnego światła następuje rozwój form przetrwalnikowych i po 18-96 godz. (w zależności od organizmów) – wylęg młodych osobników gotowych do wykorzystania jako element biologiczny eliminacja hodowli pozwala na obniżenie kosztów Wykorzystanie standardowych organizmów umożliwia standaryzację testu i otrzymanie powtarzalnych wyników w różnych laboratoriach.

34 Wykaz mikrobiotestów dostępnych na rynku

35 ALGALTOXKIT F™ Test hamowania wzrostu 72 godzinny przesiewowy mikrobiotest czystych substancji, cieków, wód powierzchniowych i głębinowych. Zawiera wszystkie elementy do przeprowadzenia 2 testów badania hamowania wzrostu w świeżej wodzie alg Selenastrum capricornutum. Organizmy testowe są składnikiem zestawu, w postaci „kulek”, które mogą być na żądanie ożywiane i gotowe do użycia w czasie krótszym niż 30 minut, poprzez dostarczenie pożywki do prowadzenia próby

36 Kryteria prowadzenia testu : Mikrobiotest ALGALTOXKIT F pozwala w ciągu 72 godzin ocenić hamowanie wzrostu mikro-alg, przy obliczeniach 72h EC 50 Zalety testu i ekonomia jego stosowania : Unikalne jednorazowe kuwety-pojemniczki ekspozycyjne, które służą jednocześnie jako kuwety pomiarowe dla bezpośredniego określenia wzrostu alg poprzez pomiar gęstości optycznej. Nakład pracy przy wykonaniu testu jest znacząco zredukowany poprzez bezpośredni pomiar wzrostu alg w kuwetach przy użyciu kolorymetru z filtrem 670 nm lub spektrofotometru przystosowanego do długich kuwet. Okres składowania podłoży wynosi kilkanaście miesięcy, przy właściwych warunkach składowania, redukując tym samym koszty realizacji zakupów kolejnych zestawów.

37 Biomonitoring wód Soprobiologia biologia ścieków wodnych, zajmuje się wodami zanieczyszczonymi i organizmami tam żyjącymi ( saprobiont y) Rodzaj zanieczyszczenia i stężenie ścieków wpływa na rozwój organizmów. Wody przeżyźnione to wody kiper i politroficzne. Gdy wzrasta ciągle udział biogenów to wody są saprofityczne. Bioindykacja: określenie toksyczności różnych elementów środowiska na podstawie reakcji żywego układu oraz na podstawie pomiaru jakościowego i ilościowego tych reakcji. ochrona wód: klasy czystości wód gatunki flory i fauny słodkowodnej wykorzystywane jako bioindykatory strefy saprobowe

38 saproby – organizmy żyjące w strefie rozkładu materii organicznej saprobowość - natężenie wszystkich biologicznych procesów rozkładu, co w odniesieniu do wody oznacza działalność mikroorganizmów (bakterii, grzybów) oraz zwierząt. ZRÓŻNICOWANIE WYMAGAŃ: organizmy o dużych wymaganiach: larwy widelnicy, jętki, wstężnica, larwy chruścika, małż z rodziny skórkowatych, złotowiciowiec wstężnica Cylan organizmy o umiarkowanych wymaganiach: euglena, pantofelek, glony (zielnice) skrętnica, skorupiaki (larwy ważek ośliczki, ślimak, pijawki, kiełż. organizmy o małych wymaganiach: bakterie (drągownica) larwy muchy gnojki, otoczka

39 Strefa hipersaprobowa – ścieki – bakterie, bezbarwne wiciowce Strefa polisaprobowa – redukcja materii organicznej (beztlenowa) – nitkowate bakterie siarkowe, wiciowce barwne i bezbarwne, orzęski, pierścienice, ochotkowate Strefa alfamezosaprobowa – procesy utleniania i redukcji – bakterie, grzyby (Leptomites), wiciowce, orzęski, sinice, tubifexy, czerwone larwy ochotkowatych Strefa betamezosaprobowa – woda słabo zanieczyszczona – dominują okrzemki, zielenice, sinice, larwy jętek, chruścików i ślimaków Strefa oligosaprobowa – woda czysta – okrzemki, złotowiciowce, krasnorosty, larwy jętek, widelnic, chruścików, wirki, larwy ochotkowatych żółte i zielone Strefa katarobowa – wody źródlane i górskie – niska zawartość związków mineralnych i organicznych, okrzemki, złotowiciowce, krasnorosty, mięczaki, skorupiaki Strefa kryptosaprobowa – dużo zawiesiny mineralnej Strefa antysaprobowa – dużo związków toksycznych, metali ciężkich, pestycydów

40 Indeks saprobowy: gdzie: Sn = sn*hn sn – stopień saprobowości dla danego gatunku hn – częstotliwość występowania dla danego gatunku Sn – wartość saprobowa dla danego gatunku S – indeks saprobowy wyznaczony dla danego punktu pomiarowego Określenie klasy czystości wody na podstawie wartości indeksu „S”

41 Bioeksperymenty  Aby dokładniej zbadać skomplikowane procesy i zależności toksycznych substancji chemicznych z organizmami występującymi w danym ekosystemie przeprowadza się eksperymenty w mozosystemach : izolowane wycinki jeziora lub sztuczne strumienie, do których w sposób kontrolowany doprowadza się związki chemiczne Mikrosystemy  z zastosowaniem dużych (kilkuset litrowych) naczyń, do których wprowadza się zespoły organizmów Tutaj symuluje się warunki dominujące w sposób naturalny w badanym ekosystemie Może to być źródło informacji o wpływie substancji toksycznych zarówno na poszczególne gatunki, poziomy troficzne jak i całą społeczność zamieszkujących tam organizmów.

42 Po śmierci zwierząt przeprowadza się obserwacje mikro- i makroskopowych zmian w narządach, które zaszły podczas ekspozycji na toksynę. ZESTAW BADAŃ SPECJALNYCH określających: ( przy toksyczności przewlekłej) działanie kancerogenne ( rakotwórcze), zaburzenie mechanizmu wzrostu tkanki działanie mutagenne ( zmiana cech dziedzicznych, uszkodzenia DNA) efekt embriotoksyczny lub teratogenny (uszkodzenie lub śmierć embrionu lub płodu)