Mikroskopia jako narzędzie obserwacji

Cele: Poznanie budowy, zastosowania i umiejętność posługiwania się mikroskopem jako jednym z narzędzi obserwacyjnych stosowanych w biologii Zapoznanie z budową mikroskopu optycznego, zasada jego działania (droga światła i formowanie obrazu- podstawowe zasady optyki) Umiejętność złożenia mikroskopu, przygotowania prostego preparatu, analiza obserwowanego obrazu Zjawisko immersji w mikroskopie optycznym Zapoznanie z pracą mikroskopu elektronowego -transmisyjnego -skaningowego 5. Zastosowanie różnych rodzajów mikroskopu w zależności od rozmiaru badanego obiektu 6.Powtórzenie i ugruntowanie wiadomości

Mikroskop optyczny jest przyrządem służącym do zwiększenia kąta widzenia przedmiotów położonych w odległości dobrego widzenia oka. Składa się on z dwóch układów MECHANICZNEGO (manipulowanie preparatem) I OPTYCZNEGO. W skład optycznego wchodzą 2 układy zbierające – obiektywu i okularu, w których do maksimum skompensowano wpływ wad soczewek (aberracji sferycznej i chromatycznej). Źródłem tworzenia obrazu jest wiązka promieni świetlnych Zdolność rozdzielcza: najmniejsza odległość między dwoma punktami obiektu, przy której są one rozróżnialne jako oddzielne. Przy 1000 krotnym powiększeniu jest to ok. 0,2 µm

Zapoznanie z budową mikroskopu optycznego 1 – Okular 2 – Rewolwer – obrotowa tarcza zawierająca zestaw obiektywów o różnym rodzaju powiększenia i aperturze numerycznej 3 – Stolik 4 – Kondensor – koncentruje wiązkę promieni świetlnych o dużej intensywności formując z nich stożek wystarczający do oświetlenia pola przedmiotowego 5 – Przesłona / źródło światła – przesłony głównie mają za zadanie zmniejszenie ilości padającego światła, w zależności od miejsca umieszczenia mogą, np. zwiększać głębię ostrości lub zmniejszać wady optyczne 6 – Podstawa 7 – Śruba regulacyjna – umożliwia ułożenie próbki znajdującej się na stoliku na odpowiednią odległość tzw. odległość roboczą od obiektywu 8 – Statyw 9 - Tubus – jest to przestrzeń pomiędzy obiektywem a okularem, w której formuje się obraz

Poprawa jakości obrazu Jeśli na obudowie brak jakichkolwiek oznaczeń poza powiększeniem oznacza to, że mamy do czynienia z obiektywem achromatycznym i są skorygowane dla dwóch zakresów długości fal światła Np.: Poprawa jakości obrazu skorygowane dla trzech, lub większej ilości długości fal, większa rozdzielczość

Układ optyczny mikroskopu Obraz, jaki daje okular jest pozorny, prosty, powiększony Obiektyw daje obraz powiększony, odwrócony i rzeczywisty

Rys.1. Bieg promieni w mikroskopie Przedmiot OA umieszczony jest w niewielkiej odległości za ogniskiem obiektywu. Obiektyw daje obraz powiększony, odwrócony i rzeczywisty – obraz O1A1 jest przedmiotem dla okularu i znajduje się między ogniskiem a okularem. Obraz, jaki daje okular jest pozorny, prosty, powiększony O2A2 i znajduje się w odległości dobrego widzenia od okularu. Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia obiektywu i okularu: W naszym mikroskopie obiektyw powiększ 10x a okular 4x, 10x,40x,100 x

Obraz pozorny – obraz przedmiotu, który powstaje w wyniku przecięcia się przedłużeń promieni rzeczywistych po ich przejściu przez układ optyczny. Obraz pozorny nie jest widoczny na ekranie. Obraz ten jest widoczny dla obserwatora rejestrującego rozbieżną wiązkę promieni opuszczających układ optyczny. Nasze zmysły, przyzwyczajone do prostoliniowego rozchodzenia się światła, lokują obraz w miejscu, w którym w rzeczywistości nie biegną żadne promienie - stąd nazwa obrazu pozornego. Efekt ten bywa wykorzystywany w pokazach iluzjonistycznych. Obraz powstający w zwierciadle płaskim.

Zdolność rozdzielcza obiektywu (2 Zdolność rozdzielcza obiektywu (2.5) jest definiowana jako najmniejsza odległość pomiędzy dwoma punktami próbki, które mogą być wciąż rozpoznawalne przez obserwatora jako osobne elementy. a)- ograniczona możliwość odróżnienia dwóch punktów b)- brak możliwości odróżnienia dwóch punktów

Immersja 1 – obiektyw mikroskopu; 2 – olejek imersyjny; 3 – preparat Imersja, immersja (z łac. immergo – zanurzam) – metoda stosowana w mikroskopii w celu zwiększenia zdolności rozdzielczej mikroskopu optycznego poprzez wypełnienie przestrzeni pomiędzy preparatem a obiektywem przezroczystą cieczą (cieczą imersyjną) o współczynniku załamania zbliżonym do współczynnika załamania szkła soczewki; często jest to olejek cedrowy. Zapobiega to załamaniu się światła po przejściu ze środowiska optycznie gęstszego (szkła) do środowiska optycznie rzadszego (powietrza) i zaciemnieniu pola widzenia (zwiększana jest apertura liczbowa obiektywu mikroskopu). Obiektyw z cieczą imersyjną potocznie nazywany jest soczewką imersyjną.

Co zobaczymy w mikroskopie optycznym: -organizmy o rozmiarach 1mm-1µm (0,2µm) -żywe (w kropli płynu) lub martwe (po odpowiednim utrwaleniu) -unieruchomione lub w ruchu np.:paramecium -naturalne lub wybarwione - W wersji fluorescencyjnej: wybarwione znacznikami wielokolorowymi-wymaga innego zestawu soczewek Wyposażenie: -mikroskop -szkiełka podstawowe -szkiełka nakrywkowe -zakraplacz -woda destylowana -igła preparacyjna lub/i inne narzędzie tnące -olejek immersyjny (najlepiej cedrowy) -preparat do odtłuszczania, czyszczenia szkiełek i obiektywów -bibuła , szmatka nie pozostawiająca drobin

-Czy to wystarcza ? -Potrzebujemy narzędzia do czulszych obserwacji w dużo mniejszej skali: -obserwacja: Pęd fotonów jest niewielki i dlatego długość fali świetlnej jest relatywnie duża w skali mikroświata. Nawet najlżejsze cząstki elementarne mają pęd znacznie większy od fotonów. W ten sposób narodził się pomysł wykorzystania w mikroskopii elektronów.

Mikroskop elektronowy: -obraz uzyskujemy przepuszczając wiązkę elektronów przez mikroskop (kolumnę próżniową z kompletem soczewek) -soczewki są elektromagnetyczne -obraz preparatu jest nanoszony na kliszę fotograficzną lub monitorowany kamerą telewizyjną -brak obserwacji bezpośredniej –OBSERWACJA POŚREDNIA -obserwowane obiekty są MARTWE (musza być nieruchome) -bardzo trudno wykonać tak cienki preparat Ogólnie mikroskopy elektronowe można podzielić na zwykłe - TEM (powiększenie 1 000 000x –rozdzielczość 0,2 nm)oraz skaningowe-SEM.(powiększenie 500 000x-rozdzielczość 1nm) 1.W mikroskopach zwykłych jednocześnie analizowany jest duży obszar powierzchni preparatu i tworzony jest jego obraz. 2.W mikroskopach skaningowych w danym momencie analizowany jest niewielki obszar, który jest traktowany jako punkt. Tworzenie obrazu następuje poprzez zebranie informacji z kolejno analizowanych punktów.

Elektronowy mikroskop transmisyjny (en: Transmission Electron Microscope) - rejestrowane są elektrony przechodzące przez próbkę. Próbka w takim mikroskopie musi być cienką płytką o grubości mniejszej od 0,1 mikrometra. Przygotowanie takiej próbki jest trudne i znacznie ogranicza zastosowania mikroskopu. kolumna mikroskopu (1) działo elektronowe (2) wiązkę elektronów (3) katoda (4) i anoda (5) Zwiększenie napięcia pozwala na zwiększenie pędu elektronów, co zmniejsza długości fali Aby elektrony mogły przebyć drogę od działa elektronowego do ekranu konieczne jest utrzymywanie w kolumnie bardzo dobrej próżni. Soczewki i cewki ogniskujące(6) Istotną zaletą soczewek elektromagnetycznych jest możliwość płynnej zmiany ich ogniskowych przez regulację natężenia prądu przypływającego przez soczewkę. preparat (7) obiektyw (8) - okular (9) Youtube: Prezentacja - Mikroskop elektronowy detektor (10)

Mikroskopy skaningowe przeglądają powierzchnię próbki punkt po punkcie Mikroskopy skaningowe przeglądają powierzchnię próbki punkt po punkcie. Elektrony nie przechodzą przez próbkę, lecz „skanują” oblepiają jej powierzchnię, wchodzą w interakcje z elektronami próbki i wybijają je- im bardziej wypukła powierzchnia tym więcej wybitych elektronów. Elektrony zlicza komputer tworząc obraz przestrzenny.