Badania in vitro nad wpływem bendamustyny zastosowanej pojedynczo lub w skojarzeniu z rytuksymabem na komórki przewlekłej białaczki limfocytowej z uwzględnieniem stanu mutacyjnego IGVH. Ewelina Ziółkowska Katedra i Klinika Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Tadeusz Robak Promotor pracy doktorskiej: prof. dr hab. n. med. Anna Korycka-Wołowiec Szczecin, 25 wrzesień 2015

Przewlekła białaczka limfocytowa Choroba nowotworowa morfologicznie dojrzałych limfocytów CD19/CD23/CD5

Czynniki rokownicze w PBL Klasyczne czynniki rokownicze Markery surowicze Aberracje cytogenetyczne Markery powierzchniowe i cytoplazmatyczne komórek białaczkowych Mutacja IGVH Mutacja IGVH Mutacje genów NOTCH1, SF3B1, BIRC3, CLLU1 LPL microRNA

Przewlekła białaczka limfocytowa Zahamowanie apoptozy + niekontrolowana proliferacja akumulacja dojrzałych limfocytów białaczkowych

Białka regulujące apoptozę Białka regulujące apoptozę P53 Białka rodziny BCL-2 APAF1FASFASLFADD Kaspazy inicjatorowe i efektorowe

Białka z rodziny BCL-2 Białka proapoptotyczne  BAX  BAK  BOK  BIM  BAD  BID  PUMA Białka antyapoptotyczne  BCL-2  BCL-X L  BCL-w  MCL-1 1 domena BH 3  HRK  BIK  BMF  NOXA białka wielodomenowe 4 domeny BH 3

Struktura chemiczna BENDAUSTYNY Łańcuch kwasu masłowego: właściwości amfoteryczne Chlorowodorek: dobra rozpuszczalnośćw wodzie Pierścień benzoimidazolu: analogi puryn Alkaliczna grupa aminowa: leki alkilujące

JądrokomórkoweBłonakomórkowa Receptor Fas Kompleks DISC DISC FADD Kaspaza-8 Kaspaza-3 Kaspaza-9 Apoptosom APOPTOZA Cytochrom C APAF-1 Prokaspaza-9 Cytozol P53 BENDA PUMA ? Bax/Bak BCL-2 P53 ? Zahamowanie punktów kontroli cyklu komórkowego Nieskuteczna naprawa DNA MARTWICA Fas L BENDA ?

Rytuksymab - przeciwciało monoklonalne

Rytuksymab Bezpośrednia indukcja apoptozy Efekt szczepionki Cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC) Cytotoksyczność zależna od przeciwciał (ADCC) Komórka żerna DOPEŁNIACZ

CELE PRACY 1.Ocena wpływu BENDA i RIT na apoptozę komórek PBL in vitro, w środowisku zawierającym surowicę własną pacjenta. 2.Ocena wpływu badanych leków na zmianę potencjału mitochandrialnego 3.Ocena wpływu badanych leków na ekspresję wybranych białek apoptotycznych, Ocena powyższych parametrów w zależności Ocena powyższych parametrów w zależności od stanu mutacyjnego IGVH. od stanu mutacyjnego IGVH.

MATERIAŁ (1) Krew obwodowa 34 nieleczonych chorych na PBL (13 K i 21 M) Wiek 22 – 83 (średnia: 66 lat) Ocena stanu mutacyjnego IGVH - 18 chorych ze zmutowanym genem IGVH (IGVH +) - 16 chorych z niezmutowanym genem IGVH (IGVH-)

MATERIAŁ (2) BADANE LEKI: BADANE LEKI: - Chlorowodorek bendamustyny (BENDA) - stężenie 40 µg/ml - Chlorowodorek bendamustyny (BENDA) - stężenie 40 µg/ml - Rytuksymab (RIT) - stężenie 10 µg/ml - Rytuksymab (RIT) - stężenie 10 µg/ml Badanie uzyskało akceptację Komisji Bioetyki przy Uniwersytecie Medycznym w Łodzi nr RNN/111/07/KE z r. z popr. z r. Badanie uzyskało akceptację Komisji Bioetyki przy Uniwersytecie Medycznym w Łodzi nr RNN/111/07/KE z r. z popr. z r.

PROCEDURA HODOWLI

Ocena apoptozy komórek białaczkowych po inkubacji z badanymi lekami: -test z Anneksyną-V i JP (test Ann-V/JP) METODY (1)

Ocena ekspresji białek: P53, BAX, BAK, BCL-2, PUMA, APAF-1, FADD METODY (2) Ocena stężenia aktywnych form kaspazy -9, -8 i -3 Ocena stężenia aktywnych form kaspazy -9, -8 i -3 Ocena zmiany potencjału błony Ocena zmiany potencjału błony mitochondrialnej (  m ) mitochondrialnej (  m )

ANALIZA STATYSTYCZNA Test Wilcoxona z poprawką Bonferroniego na wielokrotne porównania (p < 0,0012) Test Manna-Whitneya (p < 0,05)

WYNIKI

Ocena apoptozy komórek PBL DIA – (drug induced apoptosis) – apoptoza indukowana lekiem, Różnice istotne: # - vs Kontrola * - vs RIT  - vs BENDA DIA(%) 17,6 4,1 18,5 15,5 4,5 17,6 # # # # # # * * * * ♦

Ocena zmian potencjału mitochondrialnego (  m ) # # # # # # * * * * ♦ ♦ Różnice istotne: # - vs Kontrola * - vs RIT  - vs BENDA DI  m (%) 27,8 6,0 33,0 29,1 4,5 31,1 DI  m - (drug induced  m ) - zmiany potencjału mitochondrialnego indukowane lekiem

Ocena aktywnych form kaspaz -9, -3 i -8. # # # # # # * * * * # # # # # * * * * # # # # # # * * * * ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ DIE(%) 26,8 5,1 30,9 24,9 5,9 30,2DIE(%) 25,1 5,3 28,4 24,7 0,0 23,6 DIE(%) 23,5 3,9 28,5 25,2 3,8 27,5 DIE – (drug induced expression) – ekspresja indukowana lekiem, Różnice istotne: # - vs Kontrola * - vs RIT  - vs BENDA

* # * * * # # # # # Różnice istotne: # - vs Kontrola * - vs RIT * - vs RIT Białko P53, a mutacja IGVH A - Kontrola B - BENDA C - RIT D - BENDA + RIT

Różnice istotne: # - vs Kontrola * - vs RIT * - vs RIT # # # # * * * * Białko BAX, a mutacja IGVH A - Kontrola B - BENDA C - RIT D - BENDA + RIT

Białko PUMA, a mutacja IGVH * # Różnice istotne: # - vs Kontrola # - vs Kontrola * - vs RIT * - vs RIT A - Kontrola B - BENDA C - RIT D - BENDA + RIT

Białko APAF1, a mutacja IGVH Różnice istotne: * - vs RIT *

Białka FADD i BCL-2, a mutacja IGVH

OBSERWACJE 1.BENDA zastosowana pojedynczo i w skojarzeniu z RIT, po 48-godz. inkubacji i w obecności surowicy autologicznej, wykazywała znamiennie silniejsze działanie cytotoksycznie i proapoptotyczne na komórki PBL niż RIT, indukowała spadek potencjału mitochondrialnego oraz zwiększała ekspresję kaspazy -9, -3 i W całej badanej grupie BENDA zastosowana pojedynczo i w skojarzeniu z RIT znamiennie zwiększała odsetek komórek wykazujących ekspresję białka P53, BAK i BAX w porównaniu z RIT, oraz białka PUMA w porównaniu z kontrolą. Nie wykazano wpływu badanych leków na odsetek oraz na MFI pozostałych badanych białek. 3. W grupie chorych z niezmutowanym genem IGVH, BENDA zastosowana łącznie z RIT powodowała znamienne pobudzenie ekspresji białek PUMA i APAF1 w porównaniu z RIT zastosowanym samodzielnie.

WNIOSKI 1.Wzmocnienie działania proapoptotycznego BENDA poprzez jej łączne zastosowanie z RIT w warunkach in vitro uzasadnia kontynuację badań nad skutecznością takiego skojarzenia u chorych na PBL. 2.Ze względu na odmienności w odpowiedzi komórek PBL in vitro na badane leki w zależności od stanu mutacyjnego IGVH, celowe wydaje się pogłębienie badań nad wpływem IGVH na apoptozę komórek białaczkowych zarówno spontaniczną, jak i indukowaną lekami. Uzasadnione są też dalsze badania nad skutecznością kliniczną BENDA z RIT w zależności od stanu mutacyjnego IGVH.

Dziękuję za uwagę