CHOROBA REPLANTACJI SADÓW I MOŻLIWOŚCI OGRANICZANIA JEJ SKUTKÓW P. Sobiczewski Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa, Skierniewice Seminarium inauguracyjne Projektu LIFE, Warszawa,

Sadzenie drzew owocowych po świeżo usuniętym sadzie → ‘zmęczenie gleby’ → choroba replantacji Fot. Sylwester Masny

Wzrost i plonowanie jabłoni odm. Topaz w czwartym roku po posadzeniu E. Pacholak, 2004

Etiologia = kompleks szkodliwych czynników biotyczne grzyby i organizmy grzybopodobne, bakterie, promieniowce, nicienie... Cylindrocarpon destructans, C. olidium; Phytophthora cactorum, P. syringae; Pythium (co najmniej 15 gatunków/4 nowe); P.abappressorium, P. attrantheridium); Rhizoctonia solani Nicienie (P. penetrans ) Mazzola, 1997; 1998; Mazzola et al., 2002 Paulitz et al., 2003, Allain-Boulé et al., 2004 abiotyczne brak równowagi pokarmowej, nieodpowiedni odczyn gleby, zła struktura gleby, nagromadzenie substancji szkodliwych...

Badania w Polsce Prof. Zofia Rebandel, a szerzej prof. Eugeniusz Pacholak i Jego Zespół z Akademii Rolniczej w Poznaniu Prof. Adam Szczygieł z ISK, SZD Brzezna k/ Nowego Sącza: Choroba replantacji występuje w ponad 50% sadów w Polsce, zwłaszcza na glebach lekkich

Północno-zachodnie rejony USA ponad 50% jabłek produkowanych w USA Ogromny problem dla sadowników i szkółkarzy Corocznie replantowane jest ponad 5000 ha sadów Walka z chorobą to m.in. fumigacja gleby bromkiem metylu czy chloropikryną - Protokół ONZ z Montrealu (1987) – substancje zmniejszające powłokę ozonową powinny być wycofane w krajach rozwiniętych do końca 2005 r., a rozwijających się do 2015 r. - Tymczasem UE dopuszcza ich stosowanie najdalej do 18 marca 2010r.

Ukierunkowana modyfikacja środowiska, tak, aby sprzyjało ono wzrostowi i produktywności posadzonych roślin, a jednocześnie ograniczało szkodliwe dla nich czynniki » odpowiednie zmianowanie » uprawa roślin fitosanitarnych jako przedplon (materia organiczna, biofumigacja) Metoda agrotechniczna

Pszenica jako roślina fitosanitarna Mazolla, 2006

KombinacjaCylindro -carpon FusariumPythiumRhizocto -nia Trichoder- ma Kontrola Gleba pasteryz. Rajgras Pszenica: ‘Daws’ ‘Eltan’ ‘Penawawa’ ‘Sprague’ ‘Symphony’ 52 d 0 a 47 d 14 ab 34 c 19 b 8 ab 6 ab 11 b 8 ab 17 c 7 ab 8 ab 17 c 5 a 19 c 8 a 1 a 4 a 0 a 10 a 1 a 2 a 1 a 17 b 1 a 4 a 0 a 7 a 0 a 23 c 6 a 1 a 4 a 1 a 18 b 0 a 3 a Występowanie grzybów (%) na korzeniach siewek jabłoni odm. Gala posadzonych do gleby z chorobą replantacji, w której uprawiano pszenicę lub rajgras jako przedplon Yu-Huan Gu, Mazzola, 2003

KombinacjaSad 1 (CV)Sad 2 (WCC) Kontrola Rajgras Pszenica: ‘Daws’ ‘Eltan’ ‘Penawawa’ ‘Sprague’ ‘Symphony’ 2,6 a* 4,9 b 6,8 c 13,6 e 8,3 d 7,1 cd 10,9 d 6,5 a* 7,9 a 21,4 c 13,5 b 20,8 d 17,4 c 17,5 c Wpływ uprawy pszenicy lub rajgrasu na populacje bakterii z rodzaju Pseudomonas w glebach z chorobą replantacji Yu-Huan Gu, Mazolla, 2003 *jtk x 10 5 g -1

Rośliny kapustowate - glukozynolany

Kombinacja Całkowita liczba bakterii Fluoryzujące Pseudomonas spp. Pythium spp. Kontrola Gleba pasteryzowana 0,1% ‘Dwarf Essex’ 1% ’Dwarf Essex’ 7,4 a* 9,0 b 8,6 b 9,0 b 5,9 b* 6,7 c 7,5 d 3,8 a 146 b* 0 a 40 a 50 a Wpływ dodatku mączki z nasion rzepaku do gleby z chorobą replantacji na populacje mikroorganizmów Wg Mazzola i in *lg jtk/g gleby

Pseudomonas fluorescens Pf5 (wytwarza pyrrolnitrynę i pyoluteorynę) - Rhizoctonia solani - Thielaviopsis basicola - Verticillium dahliae - Alternaria spp. - Pythium ultimum - Erwinia carotovora

Kombinacja Kontrola BACT-1* EBW-4* B-10* B-8** SE 0,50 0,31 0,85* 0,58 0,63 0,09 1,71 1,46 3,59* 2,89 1,85 0,64 4,31 3,64 7,14* 5,04 3,69 0,37 Wpływ bakterii PGPR na plon jabłek z drzew posadzonych do gleby zmęczonej (kg/drzewo ) Utkhede i Smith, 1992 * B. subtilis; ** E. aerogenes

Zgnilizna pierścieniowa podstawy pnia jabłoni Phytophthora cactorum

KombinacjaSposób aplikacji Dawka sa/jtk/drz. Plon kg Stopień porażenia 1-5 Kontrola Fosetyl-Al. Metalaxyl (granulat) Metalaxyl E.aerogenes (B8) SE Dolistnie Podlewanie Rozsianie Podlewanie 5 g 10 g 1 g 10 18,8 b 24,8 a 19,9 b 24,0 a 24,9 a 26,2 a 1.1 2,0 a 1,5 bc 1,6 bc 1,4 c 1,5 bc 1,7 b 0,06 Wpływ metod chemicznej i biologicznej na nasilenie zgnilizny pierścieniowej podstawy pnia jabłoni zgnilizny pierścieniowej podstawy pnia jabłoni i plonowanie drzew i plonowanie drzew Utkhede i Smith, 1991

Badania w Instytucie Sadownictwa i Kwiaciarstwa w Skierniewicach w latach Fot. R. Sałuda

Grzyby: ● Zbiorowiska grzybów z gleby ‘chorej’ i nowiny nie różniły się jakościowo i ilościowo. ● W obu rodzajach gleb najbardziej liczne były populacje grzybów: Penicillium, Cladosporium, Paecilomyces, Trichoderma, Umbelopsis, Gliocladium i Fusarium, a liczebność: Zygorhynchus, Humicola, Rhizopus, Mucor, Gymnoascus, Botrytis, Alternaria i drożdże była stosunkowo niewielka. ● Nie stwierdzono obecności Rhizoctonia, Cylindrocarpon, Pythium i Phytophthora Nasze badania: Etiologia choroby (próbki gleby z kwater z chorobą replantacji oraz bez choroby)

Nicienie Zarówno w glebie ‘chorej’, jak i nowinie liczba nicieni z rodzaju Pratylenchus była niewielka i nie może być uznana jako czynnik chorobotwórczy W glebie ‘chorej’ stwierdzono znaczną liczbę Tylenchorhynchus dubius jednak nie przekraczała ona progu ekonomicznej szkodliwości Zasobność i pH obu rodzajów gleb były podobne

Przypuszczalnie substancje toksyczne i/ lub inne nie rozpoznane czynniki mogły powodować chorobę replantacji

NASZE BADANIA: Możliwość eliminacji skutków choroby replantacji w sadach poprzez uprawę roślin fitosanitarnych i inne zabiegi poprawiające właściwości gleby Wpływ roślin fitosanitarnych oraz innych zabiegów agrotechnicznych i ochronnych stosowanych w glebie ‘zmęczonej’ na populacje zasiedlających ją bakterii i grzybów Wykorzystanie bakterii i wyciągów z roślin do przeciwdziałania chorobie replantacji

1. Możliwość eliminacji skutków choroby replantacji w sadach poprzez uprawę roślin fitosanitarnych i inne zabiegi poprawiające właściwości gleby A. Uprawa roślin fitosanitarnych Pszenice: jara odm. Zebra; ozima odm. Finezja Żyto odm. Hegro Pszenżyto ozime odm. Witon Gorczyca biała Nasiona wysiewano w 3 cyklach, rośliny rosły przez 4 tygodnie, po czym ich korzenie rozdrabniano i mieszano z glebą B. Parowanie gleby: 110 o C, 2 h w 3 terminach, ok. 6 tygodni przed sadzeniem siewek Antonówki C. Dodatek torfu 3:1 (tylko w 1 cyklu uprawowym 6 tygodni przed sadzeniem Antonówki) D. Dodatek mączki z nasion gorczycy w ilości 1% objętościowo (w 1 i 3 cyklu uprawowym, ok. 6 tygodni przed sadzeniem Antonówki) E. Dodatek mączki z nasion gorczycy w ilości 0,1% objętościowo (tylko w 1 cyklu uprawowym, ok. 6 tygodni przed sadzeniem Antonówki Razem 12 kombinacji

Od lewej: 1, 2 - gorczyca jako przedplon; 3, 4 – gleba zmęczona (kontrola ) Fot. W. Treder

Natężenie fotosyntezy roślin ‘Antonówki’ (po 2 cyklach, 2 termin pomiarów)

Podsumowanie Uprawa roślin fitosanitarnych, już od pierwszego cyklu uprawy, prowadziła do stymulacji wzrostu nadziemnej części siewek jabłoni Świeża masa części nadziemnej siewek, powierzchnia liści, świeża masa korzeni oraz ich długość, po zastosowaniu gorczycy (uprawa roślin lub dodatek mączki z nasion) oraz po 3 cyklach uprawy pszenicy ozimej nie różniły się istotnie w porównaniu z siewkami rosnącymi w glebie nowinie Skuteczność gorczycy i pszenicy ozimej potwierdziła analiza stanu fizjologicznego siewek ‘Antonówki’ (wyższe natężenia wymiany gazowej)

Co dzieje się w glebie z rozdrobnionymi roślinami kapustowatymi? Resztki roślinne Glukozynolany Ograniczają patogeny Zwalczają chwasty ● Dostarczają materii organicznej, w tym składniki pokarmowe Myrozynaza Izotiocyaniany Mazolla, 2006

2. Wpływ roślin fitosanitarnych oraz innych zabiegów agrotechnicznych i ochronnych stosowanych w glebie ‘zmęczonej’ na populacje zasiedlających ją bakterii i grzybów

Ogólna liczba bakterii (jtk) w 1g suchej masy gleby przed sadzeniem siewek ‘Antonówki ’ Kombinacja1 cykl2 cykle3 cykle Gleba nowina Gleba nowina parowana Gleba zmęczona Gleba zmęczona parowana Gleba zmęczona + torf Gleba zmęczona + nasiona gorczycy 1% Gleba zmęczona + nasiona gorczycy 0,1% Gleba zmęczona, pszenica jara Gleba zmęczona, pszenica ozima Gleba zmęczona, pszenżyto Gleba zmęczona, żyto Gleba zmęczona, gorczyca 45,3* bc 202,8 e 3,1 a - 0,3 a 129,6 d 6,7 a 48,2 bc 55,2 c 12,4 ab 7,2 a - 5,6* ab - 1,7 a 4,7 ab - 19,8 ab 242,2 e 88,8 d 45,6 c 24,1 b 5,6 * a - 0,7 a 0,09 a - 0,3 a - 65,7 b 100,6 c 63,6 b 56,8 b 66,2 b *N x 10 6

Liczba bakterii fluoryzujących (jtk) w 1 g suchej masy gleby przed sadzeniem siewek ‘Antonówki’ Kombinacja1 cykl2 cykle3 cykle Gleba nowina Gleba nowina parowana Gleba zmęczona Gleba zmęczona parowana Gleba zmęczona + torf Gleba zmęczona + nasiona gorczycy 1% Gleba zmęczona + nasiona gorczycy 0,1% Gleba zmęczona, pszenica jara Gleba zmęczona, pszenica ozima Gleba zmęczona, pszenżyto Gleba zmęczona, żyto Gleba zmęczona, gorczyca 0,09* ab 2,4 d 0,006 a - 0,001 a 0,3 c 0,02 a 0,01 a 0,2 bc 0,08 ab 0,09 ab - 0,002* a - 0,0005 a - 0,6 b 1,3 c 0,3 ab 0,2 a 0,01* a - 0,0001 a 0,00005 a - 0,0004 a - 0,3 b 0,6 c 0,5 bc 0,4 bc 0,5 bc *N x 10 6

Ogólna liczba grzybów (jtk) w 1 g suchej masy gleby przed sadzeniem siewek ‘Antonówki’ Kombinacja1 cykl cykle cykle Gleba nowina Gleba nowina parowana Gleba zmęczona Gleba zmęczona parowana Gleba zmęczona parowana + torf Gleba zmęczona + nasiona gorczycy 1% Gleba zmęczona + nasiona gorczycy 0,1% Gleba zmęczona, pszenica jara Gleba zmęczona, pszenica ozima Gleba zmęczona, pszenżyto Gleba zmęczona, żyto Gleba zmęczona, gorczyca 23* a 15 a 145 a c 122 a 217 ab 149 a 30 a 332 b 53 a 58 a - 67 a - 62 a 412 c c d 186 b 249 b 50 a 41 a - 39 a 119 b e d 466 e 39 a 232 c 301 d N x 10 3

Liczba grzybów (jtk) z rodzaju Trichoderma w 1 g suchej masy gleby przed sadzeniem siewek ‘Antonówki’ Kombinacja1 cykl2 cykle3 cykle Gleba nowina Gleba nowina parowana Gleba zmęczona Gleba zmęczona parowana Gleba zmęczona parowana + torf Gleba zmęczona + nasiona gorczycy 1% Gleba zmęczona + nasiona gorczycy 0,1% Gleba zmęczona, pszenica jara Gleba zmęczona, pszenica ozima Gleba zmęczona, pszenżyto Gleba zmęczona, żyto Gleba zmęczona, gorczyca 4 0, N x 10 3

Zaprawianie korzeni siewek odm. Antonówka i Wealthy przed sadzeniem do zmęczonej gleby Kombinacje/Nr. izolatu Kombinacje/Nr. izolatu / 60 M 14/ 87M 2/ IBD-7 15/ 61M 3/ 54M 16/ 59 M 4/ KONTROLA 17/ 100M 5/ Pszenżyto (eksudat) 18/ 55M 6/ 84M 19/ 82M 7/ Żyto (eksudat) 20/ Gorczyca (eksudat) 8/ 85M 21/ 112M 9/ Pszenica ozima (eksudat) 22/ 113M 10/ Pszenica jara (eksudat) 23/ 99M 11/ 109M 24/ 98M 12/ 110M 25/ 114M 13/ 111M 26/ EM rozc. 15X Reprezentanci grup bakterii 3. Wykorzystanie bakterii i eksudatów z korzeni roślin do przeciwdziałania chorobie replantacji

Najlepsze kombinacje z bakteriami: 1 (60M), 3 (54M), 15 (61M), 18 (55M), 22 (113M), 25 (114M) Wpływ sztucznej kolonizacji bakteriami korzeni siewek jabłoni odm. Wealthy, na wzrost tych siewek posadzonych do gleby ‘zmęczonej ’

Spośród ponad 600 izolatów wysobnionych z gleby ‘zmęczonej i po uprawie roślin fitosanitarnych wyselekcjonowano 6 (54M, 60M, 61M, 113M, 114M), które po sztucznej kolonizacji systemu korzeniowego siewek jabłoni istotnie poprawiały ich wzrost i kondycję po posadzeniu do gleby zmęczonej Najbardziej efektywny okazał się izolat 54M Niektóre z tych izolatów ograniczały wzrost szkodliwych organizmów z rodzajów: Cylidrocarpon, Rhizoctonia, Pythium i Fusarium

Analiza DNA izolatów bakterii ze starterami komplementarnymi do genów kodujących syntezę antybiotyków Geny kodujące syntezę antybiotyków: pyrrolnitryna, pyoluteoryna, fenazyna i 2,4- diacetylphloroglucinol Startery: prnD, pltB, pltC, (phzA i phzF lub phzC i phzD), phlD oraz dodatkowo startery komplementarne do regulatorowego genu gacA Wzorce: szczepy referencyjne Pf5, HR3A13 i 3084 Wyniki U większości efektywnie działających wykryto obecność genu gacA (425 bz), a u najefektywniejszego izolatu 54M także genu phlD kodującego syntezę floroglucinolu

Rola Pseudomonas spp., zwłaszcza P. putida w tzw. glebach opornych Fluoryzujące Pseudomonas syntetyzują floroglucinol (Phl) i odgrywają zasadniczą rolę w supresywności gleb występujących m.in. na holenderskich polderach Antybiotyk ten jest głównym determinantem aktywności bakterii pozytecznych (PGPR) Czynniki biotyczne i abiotyczne mają istotny wpływ na ekspresję genu phlA kodującego wytwarzanie Phl Phl jest także elicytorem biosyntezy fitoaleksyn

Kombinacje doświadczalne (2) Gleba ‘zmęczona’ (Z) – kontrola I Gleba ‘nowina’ (D) - kontrola II Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni gorczycy (G 1:1) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni gorczycy (G 1:3) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni pszenicy ozimej (PO 1:1) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni pszenicy ozimej (PO 1:3) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni pszenicy jarej (PJ 1:1) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni pszenicy jarej (PJ 1:3) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni żyta (Ż 1:1) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni żyta (Ż 1:3) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni pszenżyta (PŻ 1:1) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni pszenżyta (PŻ 1:3) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni owsa (O 1:1) Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni owsa (O 1:3)

Wysokość siewek Antonovki (cm)

Intensity of photosynthesis (μmol CO2 m-2 s-1) after application of exudates and selected isolates

Wysokość siewek ‘Antonówki

5/ Perspektywy wykorzystania eksudatów korzeniowych??? 2/ Potrzeba uniwersalnej metody eliminacji choroby?? 4/ Efektywne izolaty bakterii (mechanizm działania: antagonizm, stymulacja wzrostu, mutualizm…) Podsumowanie 1/ Trudności w szybkiej i precyzyjnej diagnozie (złożona etiologia) 3/ Rośliny fitosanitarne: nie tylko Brassicace; nowe gatunki i nowe odmiany (biofumigacja, odżywianie…)

Podsumowanie Wyselekcjonowanie bakterii wykazujących zdolność pokonywania negatywnych skutków choroby replantacji stwarza perspektywę ich wykorzystania w praktyce, np. w formie biopreparatu podobnego Polagrocyny,

Zespół badawczy Fitopatologia Piotr Sobiczewski Stanisław Berczyński Hanna Bryk Artur Mikiciński Joanna Puławska Agrotechnika Waldemar Treder Danuta Krzewińska Krzysztof Klamkowski

Dziękuję za uwagę

Etiologia ‘zmęczenia’ badanej gleby: Raczej nie grzyby, bakterie i nicienie, a także czynniki abiotyczne takie jak: zasobność czy skład mechaniczny gleby Przypuszczalnie: substancje toksyczne w glebie i/lub inne jeszcze nie wyjaśnione czynniki

5/ Perspectives of use plant root exudates. Are there any ?? 2/ Need of universal method for control?? 4/ Effective bacterial isolate (mechanism of action: antagonism, growth promotion, mutualism…) Conclusions 1/ Difficulties in quick and precise diagnosis (complexed etiology) 3/ Phytosanitary plants: not only Brassicace; new plant species and new cultivars (biofumigation, nutrition…)

Ogólna liczba bakterii (x10 6 ) (2-7 razy) Tabela 1 KombinacjaSadzenie antonówki Gleba zmęczona Gleba nowina Gleba zmęczona + gorczyca 1% Gleba zmęczona, gorczyca 1 cykl Gleba zmęczona, gorczyca 2 cykle Gleba zmęczona, gorczyca 3 cykle Gleba zmęczona, pszenica ozima 1 cykl Gleba zmęczona, pszenica ozima 2 cykle Gleba zmęczona, pszenica ozima 3 cykle 23 a 37 b 155 f 39 bc 64 d 95 e 53 cd 40 bc 55 cd Transformacja y = Log (x+1)

Ogólna liczba bakterii (x10 6 ) Tabela 1 KombinacjaSadzenie antonówkiKopanie antonówki Gleba zmęczona Gleba nowina Gleba zmęczona + gorczyca 1% Gleba zmęczona, gorczyca 1 cykl Gleba zmęczona, gorczyca 2 cykle Gleba zmęczona, gorczyca 3 cykle Gleba zmęczona, pszenica ozima 1 cykl Gleba zmęczona, pszenica ozima 2 cykle Gleba zmęczona, pszenica ozima 3 cykle 23 a 37 b 155 f 39 bc 64 d 95 e 53 cd 40 bc 55 cd 25 a 46 c 75 d 39 bc 40 bc 44 c 24 a 28 ab 37 abc Transformacja y = Log (x+1)

Tabela 1. Liczba grzybów (jtk) w 1 g suchej masy gleby przed sadzeniem siewek Antonówki (x 10 3 ) kombinacja Trichoderma spp. MucoralesFusarium spp.pozostałe Gl. zmęczona (1) Gl. nowina (2) gorczyca 1% (3) gorczyca 1 cykl (4) gorczyca 2 cykle (5) gorczyca 3 cykle (6) p.ozima 1 cykl (7) p.ozima 2 cykle (8) p.ozima 3 cykle (9) 10 ab 11 ab 640 d 3 a 5 ab 18 ab 6 ab 51 b 141 c 0.4 a 304 e 73 c 20 b 21 b 127 d 461 f 846 g 0 a 1 a 16 a 35 a 28 a 24 a 0.3 a 0 a 71 a 107 ab 855 f 104 ab 220 cd 235 cd 166 bc 595 a 318 d Analizę statystyczną przeprowadzono dla każdej grupy grzybów oddzielnie, test Newman-Keuls`a Trichoderma do 60 x więcej Mucorales do ponad 2000x więcej

Wysokość siewek ‘Antonówki’ Gleba ‘zmęczona’ (Z) – kontrola I; Gleba ‘nowina’ (D) - kontrola II; Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni gorczycy (G 1:1); Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni gorczycy (G 1:3); Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni pszenicy ozimej (PO 1:1); Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni pszenicy ozimej (PO 1:3); Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni pszenicy jarej (PJ 1:1) ; Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni pszenicy jarej (PJ 1:3); Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni żyta (Ż 1:1); Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni żyta (Ż 1:3); Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni pszenżyta (PŻ 1:1);Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni pszenżyta (PŻ 1:3) ; Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 50% eksudatu z korzeni owsa (O 1:1); Gleba ‘zmęczona’ z dodatkiem 25% eksudatu z korzeni owsa (O 1:3)