Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Gruźlica Wybrane Dane Epidemiologiczne Diagnosyka Laboratoryjna Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Gruźlica Wybrane Dane Epidemiologiczne Diagnosyka Laboratoryjna Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w."— Zapis prezentacji:

1 Gruźlica Wybrane Dane Epidemiologiczne Diagnosyka Laboratoryjna Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie 2005/2006

2 inf.oddech. AIDS biegunki TB malariaodra 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 zgony (mln) wiek > 5 lat wiek < 5 lat (wg. WHO Report on Infectious Diseases 1999) Zgony z powodu głównych chorób infekcyjnych (dane globalne) Zgony z powodu głównych chorób infekcyjnych (dane globalne)

3 Na świecie prątkiem gruźlicy zakażonych jest 1,9 mld osób (1/3 światowej populacji)  Rocznie na gruźlicę zapada mln osób, w tym 1,5 mln dzieci  Rocznie na gruźlicę umiera 2 mln osób, w tym 100 tys. Dzieci  95% nowych zachorowań oraz 80% zgonów z powodu gruźlicy dotyczy krajów ubogich  W krajach rozwijających się 80% chorych na gruźlicę to osoby w wieku produkcyjnym  Szacuje się, że nieleczony chory zakaża osób w ciągu roku  Problemem globalnym jest gruźlica wielolekooporna (Raporty WHO) Gruźlica na świecie

4 80 % zachorowań na gruźlicę dotyczy 22 krajów świata

5 TB notification rate, or more No report TB notification rates, 2003 The designations employed and the presentation of material on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. White lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement. © WHO 2004

6 or more No estimate Rates per , all forms of TB Estimated TB incidence rate, 2003 The designations employed and the presentation of material on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. White lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement. © WHO 2004

7 Polska Rosja Chiny Brazylia Tajlandia Indie Nigeria Kongo Etiopia Peru Indonezja Filipiny Uganda Afganistan Pol.Afryka Zimbabwe Kamb Wsp. zachorowań na gruźlicę - dane przybliżone r.

8 Polska - zapadalność na gruźlicę r. Nowo zarejestrowanych chorych (wsp. 24,9) (wszystkie postacie gruźlicy, w tym 260 więźniów,17 cudzoziedmców) kobiety (wsp. 16,2) mężczyźni (wsp. 32,9) miasta wieś Nowe zachorowania (wsp. 21,5) Wznowy (wsp. 2,8)

9 Polska – umieralność z powodu gruźlicy 2004 r. Gruźlica jako przyczyna zgonu osób Gruźlica układu oddechowego osób Zgony z powodu gruźlicy stanowiły 0,2 % ogółu zgonów Zgony z powodu gruźlicy stanowiły 37,8% zgonów z powodu wszystkich chorób zakaźnych i pasożytniczych

10 91,2 % wszystkich zachorowań stanowiła gruźlica płuc przypadków (w tym AFB+) Lokalizacja pozapłucna 821 przypadków (8,8 % nowo zarejestrowanych) 52 przypadki gruźlicy pozapłucnej z jednoczesną gruźlicą płuc inne lokalizacje to gruźlica: opłucnej 351 przypadków narządów moczowo-płciowych 111przypadków obwodowych węzłów chłonnych 143 przypadków kości i stawów 87 przypadków gruźlicze zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych 19 przypadków (w tym 2 dzieci z woj. mazowieckiego) Polska –2005 r.

11 naciekowa 87,2% pozaplucna 8,8 % serowate zapal. 1,9% włóknisto-jamista 1,5% Struktura zachorowań na gruźlicę płuc w Polsce (2005 r.)

12 Polska-zachorowania na wszystkie postacie gruźlicy wsp. / mieszk r lat wsp. 1,6 >65 lat wsp. 50,3

13 wsp. Niemcy Rep.Czeska Polska Slowacja Wegry ( wg: WHO Raport Global Tuberculosis Control) Gruźlica – zachorowania / mieszkańców

14 wsp. Ukraina Bialorus Rosja Lotwa Rumunia ( wg: WHO Raport Global Tuberculosis Control) Gruźlica – zachorowania / mieszkańców

15

16 Strategia DOTS: 1.Instytucjonalny nadzór rządowy zwalczania gruźlicy 2.Zgłaszanie przypadków bk(+) rej.służbom epidemiol. 3.Nieprzerwane 6-8 miesięczne leczenie 4.Standardowy system rejestracji i sprawozdawczości

17 Rep.Czeska Polska Francja USA Portugalia Rosja Estonia Litwa MDR na 1 lek i więcej Na podstawie: N Eng J Med. 1998,338,1641 Pneumonol Alergol Pol 1999,11-12,536 Lekooporność wśród chorych na gruźlicę w Polsce w porównaniu z innymi krajami świata (Polska , pozostałe kraje ) pierwotna nabyta

18 Polska Oporność ogółem (nowe zach.) 3,6 % 6,12% p<0,001 Oporność wielolekowa pierwotna 0,6% 1,15% p<0,001 Oporność na 4 leki 0,0% 0,5% */ p<0,001 (INH+RMP+SM+EMB) Oporność wielolekowa wtórna 7,0 % 8,55% n.s. */ 15 chorych Wzrost oporności na leki wśród szczepów Mycobacterium tuberculosis (wg. Augustynowicz i wsp. Zakażenia 1,2003) Badanie na ok szczepów gruźlicy wtórnej i ok pierwotnej

19 Laboratoryjna Diagnostyka Gruźlicy Laboratoryjna Diagnostyka Gruźlicy

20 Około 80% zachorowań na gruźlicę wykrywa się z objawów o Jedynym, niepodważalnym potwierdzeniem wstępnego rozpoznania choroby jest uzyskanie dodatnich wyników diagnostyki mikrobiologicznej o w 2005 r. wśród nowo zarejestrowanych chorych ( 9 280) jedynie u potwierdzono gruźlicę bakteriologicznie (58,3 %), wśród chorych na gruźlicę płuc 6

21 Specyfika laboratoryjnej diagnostyki gruźlicy wiąże się z: * niskim tempem namnażania się prątków na pożywkach * koniecznością stosowania wielu technik wykrywania zakażenia (mikroskopia, techniki hodowlane,techniki biologii molekularnej) Ujemne wyniki badań laboratoryjnych nie wykluczają rozwoju choroby bowiem żadna z metod laboratoryjnych nie charakteryzuje się 100% czułością

22 Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka gruźlicy obejmuje (i) bakterioskopię oraz metody molekularne (ii) wyhodowanie prątków pożywka L-J pożywki płynne z różnymi systemami detekcji wzrostu prątków (iii) określenie gatunku wyhodowanych prątków konwencjonalne metody biochemiczno- mikrobiologiczne metody molekularne (PCR, sondy genetyczne) analiza kwasów mikolowych techniką HPLC (iv) określenie lekowrażliwości

23 Miarą nowoczesności laboratorium diagnostyki gruźlicy jest spełnienie powyższych wymogów diagnostycznych w maksymalnie krótkim czasie Docelowo powinno dążyć się do skrócenia czasu diagnostyki do < 25 dni

24 Laboratoria prątka gruźlicy I Rzędu: mikroskopia II Rzędu: hodowla identyfikacja M.tuberculosis complex ocena lekowrażliwości na INH,RMP,SM,EMB III Rzędu: identyfikacja ważniejszych gatunków testy lekowrażliwości dla leków drugiej linii testy lekowrażliwości dla prątków atypowych

25 B a k t e r i o s k o p i a B a k t e r i o s k o p i a (+) (-) Wykrywa chorych silnie prątkujących Czas wykonania około 3 godzin Niska cena badania Nie różnicuje prątków żywych i martwych Nie różnicuje gatunku prątków Czułość w wykrywaniu gruźlicy w plwocinie około 30 %

26

27 barwienie metodą Ziehl-Neelsena mikroskopia w świetle widzialnym Mycobacterium sp. barwienie auraminą mikroskopia w świetle UV

28 TB n = 82 (38%) NTM n = 135 (62%) mykobakteriozy n = 9 (7%) NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 126 (93%) potwierdenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MTB Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie ( )

29 O 1-2 / 300 pól widzenia 1-9 / 100 pól widzenia 1-9 / 10 pól widzenia 1-9 / 1 pole widzenia > 9 / 1 pole widzenia Prawdopodobnie negatywny (nie wystarczająca liczba prątków dla wykrycia w bekterioskopii) Nie uznawany za pozytywny, konieczność badania dalszych próbek + (sporadyczne) ++ (nieliczne) +++ (średnio liczna) ++++ (liczne) */ przy powiększeniu 800 x x ( obecność prątków wynik

30 Pożywka Loewensteina-Jensena Pożywki płynne Czułość - około 70 % Potwierdzenie obecności żywych prątków Pozyskanie szczepu do typowania gatunku Możliwość określenia lekoporności (+) (-) Niska cena badania Czas hodowli do 8-10 tygodni Hodowla kilku - dniowa Wymogi sprzętowe H o d o w l e

31 Systemy detekcji wzrostu prątków na pożywkach płynnych *radiometryczny Bactec 460 Tb (Becton Dickinson) (możliwość różnicowania M.Tbc /MOTT) *kolorymetryczny system - MB Bac T (Organon Teknika Corporation), (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze, osobne podłoża dla próbek krwawych) *system fluorymetryczny MGIT (Mycobacterial Growth Indicatory Tube) (Beckton Dickinson) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze)

32 Identyfikacja gatunku prątków W większości laboratoriów wykonuje się jedynie test niacynowy

33 peptydoglikan arabinian łącznik  kwas mykolowy galaktan

34 LMW HMW HPLC (high pressure liquid chromatography) Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa Analiza składu kwasów mykolowych: 1.Hydroliza 2.Ekstrakcja chloroformem 3.Przekształcenie kwasów mykolowych w bromofenacylowe pochodne 4.Rozdział na kolumnie w fazie odwróconej 5.Wzór elucyjny badanej próby 6.Analiza porównawcza z biblioteką zgromadzonych wzorów elucyjnych szczepów wzoprcowych z ATCC M.tuberculosis M.avium M.interjectum

35 Metody biologii molekularnej (+) (-) Czas wykonania badania – kilka / kilkanaście godzin Czułość wykrywania gruźlicy około % Swoistość % Wykrywanie zakażeń w bardzo wczesnej fazie Stosunkowo wysoka cena badania Szkolenie, aparatura Możliwość identyfikacji jedynie 5 gatunków prątków: M.tbc complex, M.avium, M.intracellulare, M.konsasii, M.gordonae Jedynie metodą molekularną można w czasie kilku godzin wykryć obecność prątków gruźlicy bezpośrednio w materiale klinicznym

36 TB n = 113 (36%) NTM n = 199 (64%) mykobakteriozy n = 22 (11%) NTM zanieczyszczeni a środowiskowe lub kolonizacja n = 170 (89%) potwierdzenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MT Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie ( )

37 metoda i wynik liczba chorych AFB (+) hodowla (+) 62 AFB (-) hodowla (+) 51 AFB (+) hodowla (-) 20 * AFB (-) hodowla (-) 9 * ogółem 142 chorzy na gruźlicę ( ) * dodatni test molekularny(MTB) w próbkach 9 / 51 chorych wynik testu MTD był ujemny Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie

38 Systemy molekularne w diagnostyce gruźlicy * Amplicor MTB (Roche Molecular System, Somerville, New Jersey) - w systemie rozpoznaje się M.tuberculosis complex PCR * Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD) test (Gen-Probe Inc. San Diego, Ca) – w systemie rozpoznaje się M.tuberculosis complex, M.avium complex, M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.gordonae, rRNA *BDProbe Tec ET Mycobacterium tuberculosis Complex Direct Detection Assay (SDA - Strand Displacement Amplification); (Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md.) - rozpoznaje M.tbc complex, M.avium complex oraz M.kansasii SDA

39 Próbka kliniczna Dekontaminacja Zagęszczanie Izolacja DNA PCR Wykrycie produktów reakcji Amplicor MTB PCR (Roche)

40 Mycobacterium tuberculosis complex : Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium bovis BCG Mycobacterium africanum Mycobacterium microti Do niedawna nierozróżnialne metodami biologii molekularnej dopuszczonymi do diagnostyki rutynowej

41 Porównanie czułości i czasochłonności metod laboratoryjnych w wykrywaniu gruźlicy metodymolekularne hodowle mikroskopia 70 – 90 % kilka godz. 70 % kilka dni - 8 tygodni 30 % 3 godz.

42 próbka kliniczna (po wstępnym opracowaniu) hodowla ujemnadodatnia metoda molekularna Tbc nie Tbc bakterioskopia  bk - bk+ metody molekularne M.kansasii MAC M.tuberculosis lub HPLC lekooporność met. hodowlane lub met. molekularne kilkadziesiąt gatunków prątków M.tuberculosis wynik 24 h kilkanaście dni do 10 tyg. kilka godzin do 40 dni test niacynowy

43 Najczęstsze błędy laboratoryjne lub interpretacyjne w mikrobiologicznej diagnostyce gruźlicy Jednoznaczna interpretacja mikroskopii bk (+) jako gruźlicy, może być to: * gruźlica * saprofit środowiskowy – (NTM / MOTT) * mykobakterioza * w przypadku materiałów bronchoskop., zanieczyszczenie instrumentarium I

44 Brak typowania do gatunku wyrośniętych szczepów prątków - poprzestanie na wykonaniu testu niacynowego różnicujacego jedynie M.tbc oraz MOTT nie pozwala to na: * diagnozowanie mykobakterioz * wykrywanie systematycznych zanieczyszczeń prątkami środowiskowymi II

45 III Zaniechanie wzywania na dodatkowe badania mikrobiologiczne chorych ze wskazaniami klinicznymi, u których wyhodowano prątki niegruźlicze Z tej grupy rekrutują się chorzy na mykobakeriozy

46 Brak systematycznej oceny mikrobiologicznej czystości sprzętu endoskopowego IV

47 Diagnostyka uśpionych zakażeń M.tbc Latent Tuberculosis Infection - LTBI Immunologiczna diagnostyka zakażenia M.tuberculosis w warunkach in vitro

48 czas nasilenie odpowiedzi cell mediated immunity replikacja prątków przeciwciała zakażenie Odpowiedź na zakażenie M.tuberculosis choroba L a t e n t TB I n f e c t i o n

49 Zjawisko, które było podstawą współcześnie stosowanego testu tuberkulinowego opisał w 1890 roku Robert Koch, kontynuatorami jego pracy byli Charles Mantoux i Clemens von Pirquet skórny test tuberkulinowy (tuberculin skin test -TST) stosowany jest od 1907 roku.

50 komórka prezentująca antygen komórka pamięci test skórny krew - test in vitro TNF-  IL- 8 IFN-γ pomiar testu tuberkulinowego TNF-  IL- 8 IFN-γ pomiar produkcji IFN-γ

51 Czynniki negatywizujące TST: o Zależne od osoby badanej infekcje (wirusowe, bakteryjne, grzybicze) zaburzenia metaboliczne niedożywienie choroby narządów limfatycznych(np..białaczka, sarkoidoza) leki (glikokortykoidy, leki immunosupresyjne) wiek o Zależne od preparatu tuberkulinowego nieodpowieednie rozcieńczenie chemiczna denaturacja adsorpcja na szkle kontaminacja o Zła technika szczepienia o Zła technika odczytu

52 ekspozycja na M.tbc brak dowodów zakażenia 5 % zakażenie 95 % zakażanie uśpione 95 % gruźlica 5% wg E.Tortoli 2005 nie dochodzi do rozwoju choroby 90% gruźlica %

53 o Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat stworzyły test alternatywny dla skórnego testu tuberkulinowego o Jest to test in vitro nowej generacji mierzący poziom odporności komórkowej o Podstawą testu jest oddziaływanie na komórki w warunkach in vitro wysoko swoistych dla M.tuberculosis antygenów ESAT-6 oraz CP-10 stymulujących wydzielanie IFN-gamma

54 NTM Antygen M abscessus-- M avium-- M branderi-- M celatum-- M chelonae-- M fortuitum-- M gordonae-- M intracellulare-- M kansasii++ M malmoense-- M marinum++ M genavense-- M scrofulaceum-- M smegmatis-- M szulgai++ M terrae-- M vaccae-- M xenopi-- Antygen ESAT-6 CFP-10 ESAT-6 M tuberculosis ++ BCG moreau tokyo-- danish-- glaxo-- montreal ESAT-6 - early secretory antigenic target 6 CP-10 - culture filtrate protein niskocząsteczkowe białka swoiste dla M.tuberculosis pasteur CFP-10

55 QuantiFERON - TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S. Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M.tuberculosis oraz patogennych szczepów M.bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M.kansasii, M.szulgai, M.marinum Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (Latent Tuberculosis Infection -LTBI) CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55)

56 Quantiferon metoda probówkowa krew inkubacja h w 37°C badanie plazmy w teście ELISA wykrywającym IFN-γ badanie plazmy w teście ELISA wykrywającym IFN-γ dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny kolor kolor kontrola ESAT6 + CFP10 mitogen ujemna wirowanie odczytanie stężenia z krzywej standardowej odczytanie stężenia z krzywej standardowej DO 450nm IFN-  IU/ml 1 2

57 pobranie krwi pobranie krwi ESAT-6CFP-10 mitogen krew + antygeny inkubacja 24h, wydzielenie IFN-γ inkubacja 24h, wydzielenie IFN-γ ‘sandwich’ ELISA, (incubacja 120 min) dodanie substratu, reakcja barwna dodanie substratu, reakcja barwna KOLOR odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej Quantiferon – metoda płytkowa K DO 450nm IFN-  IU/ml

58 miogen – K ESAT 6 – K i / lub CFP 10 – K wynikinterpretacja  0,5  0,35 pozytywnyzakażenie prawdopodobne < 0,5  0,35 pozytywnyzakażenie prawdopodobne  0,5 < 0,35negatywnyzakażenie nieprawdopodobne < 0,5 < 0,35nieokreślonybrak wyniku QuantiFERON  TB Gold – interpretacja wyników IU IFN- γ /ml

59 pobranie krwi pobranie krwi ESAT-6CFP-10 mitogen inkubacja komórek stymulowanych antygenami w naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ inkubacja komórek stymulowanych antygenami w naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ inkubacja 24 h w 37 o C inkubacja 24 h w 37 o C ‘sandwich’ ELISA, (Inkubacja 120 min) ocena liczby barwnych plamek ocena liczby barwnych plamek kontrola separacja leukocytów jednojądrzastych separacja leukocytów jednojądrzastych kOLOR T SPOT- TB  assay metoda ocena liczby komórek syntetyzujących IFN-γ

60 Jeżeli w kontroli negatywnej.>10 lub kontroli pozytywnej <20 test nie może być interpretowany

61 Figure 1. Dot plot of individual responses to CFP-10 and ESAT-6 for 118 culture-positive patients with tuberculosis (TB) (a), 213 subjects with a low risk for TB exposure (b), and 33 TB suspects whose TB status could not be determined, as Mycobacterium tuberculosis could not be cultured (c). *For "ESAT/CFP" the data for the antigen (ESAT-6 or CFP-10) giving the highest response is shown. The dashed line represents the cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp , (2004) cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ

62

63

64

65 ekspozycja na M.tbc brak dowodów zakażenia 5 % zakażenie 95 % zakażanie uśpione 95 % gruźlica 5% wg E.Tortoli 2005 nie dochodzi do rozwoju choroby 90% gruźlica %

66 QuantiFERON - TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S. Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M.tuberculosis oraz patogennych szczepów M.bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M.kansasii, M.szulgai, M.marinum. Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (LTBI). CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55)

67

68 Schemat reakcji PCR DNA wyjściowe 1.Denaturacja termiczna 2.Przyłączanie primerów 3.Synteza nowej nici DNA (termostabilna polimeraza)

69 PCR –Polymerase Chain Reaction Polimerazowa reakcja łańcuchowa * Powielenie wybranego fragmentu DNA w cyklicznej reakcji z wykorzystaniem primerów obejmujących (flanklujących) interesującą sekwencję * Każdy cykl reakcji składa się z trzech etapów sterowanych zmianami temperatury: o C 15 sek–1,5min denaturacja o C 30 sek–2 min przyłączanie primerów wydłużanie (synteza) nowej nici DNA 72 o C 30 sek–3min * liczba cykli 20 – 40 teoretyczna liczba kopii DNA uzysklanych w reakcji PCR z 1 wyjściowej cząstki DNA = 2 n (n-liczba cykli)

70 Wizualizacja wyników testu Amplicor - MTB opiera się na technice ELISA przy użyciu: biotynylowanych primerów w reakcji PCR sondy genetycznej wiążącej swoiste DNA konjugatu awidyna - peroksydaza substratu tetrametylobenzydyny –TMB czas wykonania – 5-8 godzin

71 promotor-primer RT - odwrotna transkrypcja  rRNA/DNA rRNA rRNA DNA degradacja rRNA przez RNA-zęH, RT,  DNA/DNA primer 2 polimeraza RNA tworzy kopie RNA na matrycy DNA primer kopii RT RNA/DNA,degradacja rRNA,synteza nowej nici DNA,powrótdupleksu do cyklu promotor-primer Mycobacteriun tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen Probe) rRNA

72 * stosowaniu sond DNA znakowanych estrem akrydyny, które wiążą amplikony RNA * odrzuceniu sond niezwiązanych z RNA * odczycie wyników w luminometrze * Czas wykonanie – 6-8 godzin Wizualizacja testu Mycobacteriun tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen Probe) opiera się na:

73 BDProbe Tec ET SDA - Strand Displacement Amplification Amplifikacja z przemieszczeniem łańcucha DNA prątkowe 2-primer swoisty dla poszukiwanego DNA zawiera nukleotyd z siarką swoisty dla endonukleazy BsoB1 3- Duplex DNA (polimeraza Bst) 4- Endonukleaza BsoB1 tnie swoistą sekwencję. Ciecie nie jest efektywne (siarka!) 5- miejsce cięcia naprawia polimeraza DNA (Bst) 5'5' 5'5' 5'5' 5'5' Efektywność amplifikacji – 10 9 kopii sekwencji swoistej

74 Detekcja produktów amplifikacji w teście odbywa się na zasadzie fluorescencji Zaletą systemu jest, że amplifikacja i detekcja (na zasadzie fluorescencji) odbywa się w stałej temperaturze *System ma wewnętrzną kontrolę pozytywną *Całkowity czas wykonania testu wynosi około 140 min. *Czułość 9 CFU/reakcję (125 CFU/ml) F1 F2 sonda DNA swoiste separacja przestrzenna F1 i F2 emisja promieniowania czytnik przy braku wiązania ze swoistym DNA sygnał pobudzający F1 przenoszony jest na F2 (ET), który emituje światło o długości fali nie wykrywanej przez czytnik BD Prob Tec ET(c.d.)

75 Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii AM - badania diagnostyczne w okresie: marzec wrzesień 2003 W badaniu 900 próbek klinicznych, w których uzyskano wynik ujemny w badaniu molekularnym (PCR-MTB), w 12 przypadkach (1,7 %) uzyskano wzrost prątków M.tuberculosis w hodowli na pożywce L-J 12 przypadków gruźlicy / 900 wyników PCR (-) Amplicor MTB

76 Porównanie czułości: - met. molekularna (PCR-MTB-Roche) - hodowla - bakterioskopia PCR (+) hod. (+) 66% hod. (-) 34% plwociny popł.oskrzelowe płyny BAL wymazy z ran płyny opłucnowe popł.oskrzelowe Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii AM - badania diagnostyczne w okresie: marzec wrzesień % bk (+) 19 % bk (+)

77 czułość i swoistość testów molekularnych w diagnostyce gruźlicy czułość */swoistość*/ 70 – 90 % 97 – 100 % */ w odniesieniu do hodowli dodatnich


Pobierz ppt "Gruźlica Wybrane Dane Epidemiologiczne Diagnosyka Laboratoryjna Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w."

Podobne prezentacje


Reklamy Google