Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Podsumowanie – wykład 4 Metoda amplifikacji 3i 5 końców cDNA (RACE PCR) Wektory plazmidowe do klonowania – test selekscyjny białych i niebieskich kolonii.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Podsumowanie – wykład 4 Metoda amplifikacji 3i 5 końców cDNA (RACE PCR) Wektory plazmidowe do klonowania – test selekscyjny białych i niebieskich kolonii."— Zapis prezentacji:

1 Podsumowanie – wykład 4 Metoda amplifikacji 3i 5 końców cDNA (RACE PCR) Wektory plazmidowe do klonowania – test selekscyjny białych i niebieskich kolonii bakteryjnych Metody analizy ekspresji pojedynczych genów i całych transkryptomów Northern- blot Technika ochrony przed aktywnością RN-azy (RPA) Półilościowy RT-PCR (warunki reakcji, zasada amplifikacji) Real Time PCR (warunki i zasada amplifikacji) Analiza mikromacierzy DNA Sposoby wyciszania genów (nokautowanie, iRNA, siRNA) – przykład wyciszania genu kodującego syntazę chalkonową CHS u roślin z rodziny goryczkowatych i petuni.

2 RACE –Rapid Amplification of cDNA Ends Technika szybkiej amplifikacji 3 i 5 końców cDNA (RLM-RACE) Charakterystyka regionów promotorowych Otrzymywanie kompletnej sekwencji cDNA Gene Racer TM RACE Ready cDNA Kit Manual (Invitrogen) pz =

3 ATG Gene Racer Oligo RNA gen pompy protonowej 1359pz. GeneRacerOligo dT-3 GenePacer 5PRIMER GeneRacer 3PRIMER GSP for GSP rev Schemat dobudowywania końców 3 i 5 do znanego fragmentu genu Dołączenie oligo(dT) przy użyciu terminalnej transferazy do końca 3 Reakcja PCR z użyciem GSP (gene specific primer) i primera komplementarnego do linkera oligo dT (Gene Race 3 Primer) Przyłączenie adaptera oligo RNA na 5 Wzmocnienie swoistości amplifikacji przez PCR ze starterami swoistymi do kolejnych bardziej wewnętrznych regionów DNA (nested PCR)

4 Zakotwiczony PCR – nested PCR Zakotwiczony PCR podnosi specyficzność i intensywność produktów RACE dla 5 i 3 końców badanego genu Stosowany wówczas gdy otrzymujemy wiele transkryptów różnej wielkości lub smary po reakcji PCR matrycą jest cDNA otrzymany po pierwszej reakcji PCR startery typu nested dla 3 i 5 -specyficzne -Gene Racer

5 Białe i niebieskie kolonie bakteryjne Wykrywanie zrekombinowanych plazmidów Gen LacZ kodujący galaktozydazę pod kontrolą promotora lac W szczepie bakterii E. coli z represorem lac ekspresję genu lac indukuje się podając IPTG- izopropylo-beta –D- tiogalaktopiranozyd Aktywna beta-galaktozydaza rozkłada substrat X-Gal (5-bromo-4chloro-3 indolilo-β-D-tiogalaktopiranozyd) prowadząc do powstania niebieskiego produktu Insercja w genie lacZ prowadzi do inaktywacji enzymu stąd biała barwa kolonii.

6 PCR w czasie rzeczywistym (real time pcr) Termocykler sprzężony z fluorymetrem, który umożliwia pomiar fluorescencji w trakcie trwania reakcji PCR PCR z jednoczesną analizą przyrostu ilości produktu na podstawie fluorescencji - wykrywanie produktu we wczesnych fazach reakcji -monitorowanie kinetyki reakcji PCR w trakcie jej trwania Ilość produktu po zakończonej reakcji powinna być proporcjonalna (wykładniczo) do początkowej puli cDNA Wzrost fluorescencji jest proporcjonalny do liczy namnożonych cząsteczek DNA

7 Porównanie ekspresji metodą mikromacierzy Izolacja RNA-- odwrotna transkrypcja--cDNA (wyznakowany barwnikiem fluorescencyjnym) -barwnik czerwony (Cy5) -barwnik zielony (Cy3) Wymieszanie obu próbek cDNA Hybrydyzacja z sondami w każdej plamce mikromacierzy Wzbudzenie przez światło lasera – plamka będzie fluoryzować na czerwono jeśli -związała więcej czerwonego barwnika = nadekspresja genu w chorej tkance; odwrotnie plamka będzie fluoryzować na zielono jeśli ekspresja ulega obniżeniu w chorej tkance w porównaniu z tkanką prawidłową.

8 Nokautowanie RNA – iRNA, siRNA Wprowadzenie różnego typu dwuniciowych RNA (iRNA, siRNA) do komórki prowadzi do degradacji transkryptów mRNA – wydajna metoda do wyłączania (nokautowania genu) w celu eliminacji jego funkcji; Wprowadzenie dodatkowych kopii genu kodującego syntazę chalkonową nadającą płatkom petunii fioletową barwę zamiast nasycać barwą spowodowało,że stały się one miejscami białe. Wyciszenie genu syntazy chalkonowej przy użyciu iRNA u gatunków Gentiana triflora (goryczkowate) powoduje białe zabarwienie płatków


Pobierz ppt "Podsumowanie – wykład 4 Metoda amplifikacji 3i 5 końców cDNA (RACE PCR) Wektory plazmidowe do klonowania – test selekscyjny białych i niebieskich kolonii."

Podobne prezentacje


Reklamy Google