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生理学実習 実験5: 白血球の形態と機能 担当: D 班( 41046 ~ 41060 ) 発表:高橋(岳)、田宮、遠 山.

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1 生理学実習 実験5: 白血球の形態と機能 担当: D 班( ~ ) 発表:高橋(岳)、田宮、遠 山

2 目的 比重の違いを用い白血球を2群に分け る それぞれの白血球の全体に占める割合 を調べ、形態を観察する 好中球の遊走能を調べる ヒト末梢血を用いて

3 方法 1.末梢血液の採取 2.赤血球の沈降・除去 3.白血球の分画採取 4.標本作成(全血;中間層、ペレット) 5.形態観察

4 1.末梢血液の採取 肘静脈から 21ml の血液を採取する ―1ml は全血白血球の計測に用いる ― 残りは分画標本の作成に用いる 凝固防止のためヘパリンを十分混和す る(注射筒の壁にも塗ってある)

5 2.赤血球の沈降・除去 多糖類であるデキストランを混和する ― 赤血球をからめとることで、効率よく 沈降させられる

6 2.赤血球の沈降・除去 → 沈降前沈降後 沈降赤血球の上の層を回収して分画にまわす

7 3.白血球の分画採取 Ficoll-Paque 液を加えて遠心分離する

8 3.白血球の分画採取 Ficoll 液の比重( ) 中間層 ペレット 単球 リンパ球 好塩基球 好中球 好酸球 赤血球 血小板 1.130

9 3.白血球の分画採取 中間層 ― 単球 ― リンパ球 ― 好塩基球 ペレット ― 好中球 ― 好酸球

10 3.白血球の分画採取 中間層 ペレット

11 3.白血球の分画採取 遠心分離の後、中間層・ペレットを抽出 し、各分画を洗浄する ― 中間層分画は遠心を1回行う ― ペレット分画は一度低張液( 0.2 % NaCl )を加えて赤血球を溶血させて遠心 し、再度洗浄・遠心を行う

12 4.標本作成 (全血;中間層・ペレッ ト) 計数のための標本 全血: Turk 液(低張液)による染色 ― 余計な赤血球を除く 分画: Trypan blue による染色 ― 生きている細胞と死んだ細胞とを 見分け るために加える → 血球計算板で計数

13 <結果>白血球の数( /mm 3 ) 文献値 : 5000 ~ 8000 個人差がかなり大きい

14 5.形態観察 形態観察のための標本 May-Giemsa 染色を施した後、顕微鏡によ る観察

15 5.形態観察 ― 全血 直径 10 ~ 15μm 桿状または2~5分 葉の核 細胞質は淡いピンク 色 多数の顆粒 ①好中球

16 5.形態観察 ― 全血 直径 10 ~ 15μm 2~3分葉の核 大きさのそろった赤 紫色の顆粒が細胞質 全体に広がる ②好酸球

17 5.形態観察 ― 全血 直径 10 ~ 15μm 2~3分葉核(不定 形) 細胞質はやや紫が かったピンク色 顆粒 ③好塩基球

18 5.形態観察 ― 全血 直径 7 ~ 15μm 球形の核 細胞質は薄い青色 細胞質が少ない リンパ球の隣は血小 板 ④リンパ球

19 5.形態観察 ― 全血 直径 12 ~ 20μm 不定形(馬蹄形な ど)の核 細胞質は青色 空胞がある ⑤単球

20 5.形態観察 ― 中間層 リンパ球! 単球!

21 5.形態観察 ― ペレット 好中球! 好酸球!

22 <結果>①各白血球の割合 (%) 全血での結果(データ: D 班)

23 <結果>①各白血球の割合 (%) 分画での結果(データ: D 班) 中間層 班員 A 班員 B リンパ球 9784 単球 210 好塩基球 02 好中球 14 好酸球 00 ペレッ ト 班員 A 班員 B リンパ球 01 単球 11 好塩基球 00 好中球 8885 好酸球 1113

24 <結果>①各白血球の割合 白血球の主な成分はリンパ球と好中球で ある 中間層ではリンパ球が殆どを占める ペレットでは好中球が大部分を占める

25 <結果>②白血球の回収率 中間層: 25.3 %、 7.45 % ペレット: 61.2 %、 74.7 % → 回収率はあまり良くはない 考えられる理由 ― 赤血球を沈降させるときに一緒に失わ れる ― 数回の洗浄 ― (特に中間層で) 抽出しにくい・リンパ球が壊れやす い

26 <結果>③分画効率 中間層: 99 %、 96 % ペレット: 99 %、 98 % → 概ね分画はうまくなされている 若干のコンタミネーションはある

27 実験2 白血球の遊走能の測定

28 実験の目的 目的 白血球を分画して得られた好中球がメイ ンの細胞浮遊液を用いて、好中球の遊走 を観察する。走化性物質と阻害剤を加え て遊走能を定量し、そのメカニズムを理 解する。

29 結果の予測 予測 1.走化性物質の濃度が高いほど遊走能 は高くなる。 2.阻害剤を入れると遊走は止まるかと ても遅くなる。

30 操作手順 1.アガロースプレートの作成 2.f MLP 溶液の希釈 3.好中球遊走の観察

31 アガロースプレートの作成 材料 1. MEM ( Minimum Essential Medium ) 2.牛胎児血清・・・細胞の栄養 3. NaHCO3 ・・・インキュベーターで の CO2 との緩衝液

32 アガロースプレートの作成 穴あけ 半径方向に 沿って穴開け 機で3mm径 のウェルを3 mm間隔で放 射状に四列作 る。必ず底ま で穴を開ける こと。 アガロースプレート ウェル

33 操作手順 1.アガロースプレートの作成 2.f MLP 溶液の希釈 3.好中球遊走の観察

34 好中球遊走の観察手順 1. (好中球を含む)細胞浮遊 液を二群に分け、一方は cytochalasinB を加え、一方 は対照群として DMSO を加 える。 2. それぞれの群で、各濃度の fMLP と細胞浮遊液を右図の ようにウェルに分注してい く。 3. 二時間 CO2 存在下で培養。 4. 外、内への遊走距離を測定 し、その差(外-内)を取 る。それぞれをグラフ化す る。 内側:対照液 外側: fMLP 中 : 細胞浮遊液 細胞浮遊液 遊走 外内

35 観察の実際 f MLP 溶液細胞浮遊液 遊走距離(外側) エッジ

36 前半班の遊走距離 考察1

37 考察1:なぜある濃度以上では移 動距離が減少するのか? Y : fMLP Receptor Move→ Stop ! 好中球の ウェル fMLPの ウェル ★好中球遊走のメカニズム 答え:ある濃度以上では進行方向のレセプターが飽和し、 反対側のレセプターが埋まってゆくだけだから。 また、レセプターの脱感作もある。 予測と 違うじゃ ん !!

38 前半班の遊走距離 考察2

39 考察2:なぜ内側にも ある程度の距離を動くのか 遊走には二種類ある 1.方向性を持った 遊走 → 主に外側への遊走 2.ランダムな遊走 → 内側へ動いた距離 分、同心円状に動く 遊走範囲の概形 好中球のウェル 内側 外側

40 前半班の遊走距離 考察3

41 考察3: cytocha l asinB の働き は? cytocha l asinB はアクチンの重合阻害剤 → 予測通り、ほぼ遊走が止まった。 内側への移動も阻害されている。 → 受動的な拡散ではなくランダムな遊走 により動いていることの証拠である。

42 B 班(後半班)の遊走距離 考察6

43 考察4:高濃度f MLP で内側への 移動距離が増えたのはなぜか? ほぼ全ての走化性因子は、走化性遊走だ けでなくランダム遊走も促進する。

44 終了 文責:田中 優(実験1) 須田 万勢(実験2)

45 走化性の補足と 追加考察

46 Chemotaxis (走化性)の mechanism 濃度勾配 ( 空間微分 ) を検出 1. 直接測る 2. 経時変化 ( 時間微分)を検出しながら 動く。 (adaptation (適応)の利用) *adaptation は dynamic range (測定可能 範囲)を広げるのにも大事!

47 時間微分の例ー bacteria の鞭毛 2 -state を行き来  真っ直ぐ進む  random に方向転 換 スイッチ切り替え 直進 方向転換 直進 方向転換 (回転方向による)

48 Adaptation の利用 濃い方へ向か うときは向き を変えない! Nature Vol May 1998 Ligand の濃度にすぐ慣れる ⇒濃度の経時変化を検出可能 ligand signal Negative Feedback で適応 鞭毛

49 空間微分 ー細胞骨格を持つ Eukaryote の場合 両 side の濃度差を感知 ( Rho ) その方向に Actin の足を伸ば す PI3K から PH domain へ 更に actin 重合 (EMBO vol5 NO &nature 624,vol5, 2004) Lamelipodia ( 葉状仮足 ) - 偽足ではない

50 Actin 系は細胞運動に必須! Actin の + end を cap して重合を block Cytochalasin B

51 濃度差増幅の mechanism Dynein が中心体を actin の足場から引っ張 る その方向への actin 重合促進 ⇒運動方向の一貫化 微小な濃度差の増幅 核 中心体 運動方向 Actin の足場

52 Adaptation ー dynamic range の確保 脱感作(鈍らせる)で高濃度でも濃度差 検出 高濃度で遊走能が落ちた理由は振り切れ ( ex. 電流計)と呼ぶ方が適切であろう。 引っ込めるぶっ壊す R 不活化 Signal 不活化 Negative feedback

53 後半班の遊走距離 追加考察1

54 追加考察1:なぜ後半班では最高 濃度で移動距離が落ちなかったの か? 可能性としては 1. fMLP の濃度調整を間違えて薄い液を 作ってしまった。 2.後半斑の白血球(田宮寛之)の好中 球の fMLP 感度に対する感度が、前半班の もの(高橋岳浩)より鈍かった。 ボクは鈍感!

55 追加考察2:内側と左右の遊走距 離がほぼ等しいのはなぜか? 今回のウェルの作り 方だとf MLP の二次 的な濃度勾配が形成 された可能性が高い。 → ①~③がほぼ等距 離であることから、 一度好中球のウェル 内に均等拡散したf MLP が同心円状に浸 透 遊走範囲の概形 外側 高 内側 ①② ③ 左 右 低

56 二次濃度勾配のイメージ図 外のウェル 一次濃度勾配 二次濃度勾配白血球のウェル 外 内 いずれにせよ、濃度勾配に逆 らって動いているので、内側へ の運動は random な遊走能(化 学運動性ー chemokinesis ) を そのまま表しているとはいえな いであろう。 ここではf MLP が 自由拡散


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