„Markery sprzężone z genami odporności na porastanie i liczbę opadania w mieszańcach pszenżyta z liniami introgresywnymi Tc/Tm.*” Arleta Drozd1, Piotr.

Prezentacja na temat: "„Markery sprzężone z genami odporności na porastanie i liczbę opadania w mieszańcach pszenżyta z liniami introgresywnymi Tc/Tm.*” Arleta Drozd1, Piotr."— Zapis prezentacji:

1 „Markery sprzężone z genami odporności na porastanie i liczbę opadania w mieszańcach pszenżyta z liniami introgresywnymi Tc/Tm.*” Arleta Drozd1, Piotr Masojć1, W. Sodkiewicz2 1 Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, AR w Szczecinie 2 IGR PAN Poznań *PRACA BADAWCZA WYKONANA W RAMACH UMOWY Z AGENCJĄ NIERUCHOMOŚCI ROLNYCH NR 84/HiE/SK – 114/2002

2 Pszenżyto wyróżnia się wśród zbóż wysoką podatnością na porastanie, co zniechęca producentów do jego uprawy. Ponadto, niezależnie od porastania lub w związku z nim, następuje przedwczesna synteza dużych ilości α-amylazy, powodująca hydrolizę skrobi zapasowej z bielma. Wpływa to, na obniżenie wartości technologicznej ziarna. Aktywność α-amylazy i spoczynek ziarna są uwarunkowane przez odrębne mechanizmy genetyczne. Przy selekcji istnieje zatem konieczność uwzględniania obu cech, które ponadto są silnie modyfikowane przez środowisko. W hodowli poszukuje się nowych źródeł zmienności, a takim rezerwuarem mogą być dzikie formy zbóż, jak wykorzystana w przedstawionych badaniach pszenica T.monococcum. Znaczącą rolę w hodowli odmian odpornych na porastanie i charakteryzujących się niską aktywnością α-amylazy, może przynieść identyfikacja loci genowych, uzyskana dzięki wykorzystaniu markerów molekularnych.

3 Wykrycie markerów molekularnych wykazujących związek z odpornością na porastanie pszenżyta;
Wykrycie markerów molekularnych wykazujących związek z niską aktywnością α-amylazy; CEL PRACY Ocena możliwości wykorzystania wykrytych markerów w selekcji form pszenżyta odpornego na porastanie.

4 Dwie serie linii introgresywnch Tc/Tm, wytworzone poprzez krzyżowanie pszenżyta z syntetycznym amfiploidem AmAmRR (amfiploid ten został uzyskany w IGR PAN przez doc.W.Sodkiewicza, jako efekt prac nad pokonaniem barier niekrzyżowalności, pomiędzy diploidalną pszenicą Triticum monococcum i żytem Secale cereale cv. Dańkowskie Złote. Do wytworzenia serii A i C w charakterze biorcy genów wykorzystano linię pszenżyta heksaploidalnego LT 176/10, a w serii linii B – linię LT 522/6. Analizą objęto 57 linii introgresywnych: 22 linii serii A i C oraz 35 w serii B. Wykorzystano także pokolenie F2 i F3 (F408) , powstałe w wyniku skrzyżowania dwóch sublinii Tc/Tm z serii A, z formą odmianową Kitaro. Analizowane segreganty charakteryzowały się skrajnie różnymi wartościami porastania (SR) i liczby opadania (FN). MATERIAŁY

5 Techniki : RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Elektroforeza odbywała się 1,5 % żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. METODY b. SSR (simple sequence repeats). Elektroforeza produktów odbywała się w zdenaturowanym żelu poliakrylamidowym. Wizualizacja produktów możliwa była dzięki barwieniu żelu azotanem srebra.

6 Przy użyciu metody BSA (bulked segregant analysis) porównane zostały zbiorcze pule DNA z grup skrajnych, roślin z pokolenia F2, pod kątem występowania różnic w składzie wyróżnionych, polimorficznych fragmentów. Zasada metody BSA: Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) pr 897 (SR-) (SR+) Selekcja starterów

7 Przebadano 1000 starterów RAPD.
Seria linii B Przebadano 1000 starterów RAPD. Wyselekcjonowano 19 starterów. Analiza w obrębie form rodzicielskich i pojedynczych linii Tc/Tm Wyselekcjonowano 6 starterów , dających 7 markerów.

8 Tab. 1. Startery RAPD, które wstępnie umożliwiły
Tab.1. Startery RAPD, które wstępnie umożliwiły rozróżnienie poszczególnych osobników z grup skrajnych serii B. Lp Nr startera Długość produktu (pz) Tm LT522/6 SR+ SR – 1. 549 800bp ? 1/7 5/7 2. 579 600bp 1 7/7 3/7 3. 689 700bp 0/7 4/7 4. 749 500bp 5. 804 6 231 650bp

9 Próba potwierdzenia związku z porastaniem markerów RAPD wyodrębnionych w serii B, w obrębie linii Tc/Tm serii AC, (pr804/450pz). Pojedynki porastające (SR-) W LT176/10 LT522/6 Presto A C V,VI,IV B Tm Pojedynki nie porastające (SR+) C A C B

10 Próba weryfikacji wyodrębnionych starterów RAPD serii B w obrębie pokolenia F2, będącym rekombinantem pomiędzy linią Tc/Tm i wrażliwym rodzicem oznaczonym symbolem 3R (pr804/450pz). W B7/4/1 B7/4/2 B7/4/3 B7/4/4 B7/4/5 Tm B7/4/6 (SR+) 3R/1 3R/3 3R/4 3R/5 3R/6 Tm * (SR-)

11 Seria linii AC Przebadano 750 starterów RAPD.
Wyselekcjonowano 17 starterów. Analiza w obrębie form rodzicielskich i pojedynczych linii Tc/Tm Wyselekcjonowano starterów, dających 7 markerów

12 Tab. 2. Startery RAPD, które wstępnie umożliwiały rozróżnienie
Tab.2. Startery RAPD, które wstępnie umożliwiały rozróżnienie poszczególnych grup skrajnych w obrębie serii AC. Lp. Nr startera Długość produktu (pz) Tm16 LT176/10 SR+ SR- 1. 429 900 1 12/18 2/11 2. 745 650 13/18 4/11 3. 370 550 10/18 1/11 450 0/18 5/11 4. 1194 750 8/18 5. 753 800 17/18 6. 890 0/11

13 Próba weryfikacji wyodrębnionych starterów RAPD serii AC w obrębie pokolenia F2, będącym rekombinantem pomiędzy linią Tc/Tm i wrażliwym rodzicem (pr1039/700pz). pr1039/700pz A9/2/13 Pojedynki nie porastające (SR+) Pojedynki porastające (SR-) A9/2/22 P2/24 Tm P2/1 pr1148/500pz Pojedynki nie porastające (SR+) Tm A9/2/13 A9/2/22 P2/24 * P2/1

14 Weryfikacja tezy o przeniesieniu genów odporności na porastanie do pszenżyta z T.monococcum
Część polimorficznych prążków występujących u form odpornych, pochodziła od T.monococcum (1 marker w obrębie serii B, oraz 2 markery w serii AC); W kilku przypadkach, zarówno w obrębie serii B jak i AC, formy wrażliwe na porastanie, wykazywały obecność fragmentu pochodzącego od T.monococcum (2 markery w serii B i 1 marker w serii AC); U form sklasyfikowanych jako odporne występowały także fragmenty pochodzące od drugiego komponenta rodzicielskiego (3 markery w serii B i 2 w serii AC);

15 Pojedynki porastające (SR-)
T.m16. W LT176/10 Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) LT522/6 Presto Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B, otrzymany techniką RAPD (pr804/450pz).

16 Pojedynki porastające (SR-)
W T.m.16 LT176/10 LT522/6 Presto Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B, otrzymany techniką RAPD (pr231/650pz i 750pz).

17 Pojedynki porastające (SR-)
Pojedynki nie porastające (SR+) W LT176/10 Tm16 Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii AC, otrzymany techniką RAPD (pr972/450pz).

18 Pojedynki porastające (SR-)
LT176/10 Tm16 Pojedynki nie porastające (SR+) Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii AC, otrzymany techniką RAPD (pr429/900pz).

19 Lokalizacja chromosomowa
Tab.3 Startery SSR, wykazujące polimorfizm na pojedynkach grup skrajnych w obrębie serii B i AC. Lp. Nazwa markera Lokalizacja chromosomowa Tm LT176 LT522 B+ B- AC+ AC- 1 gwm60 7AL 0/7 3/6 0/18 4/11 2 gwm130 - 4/6 3 gwm635 7AS 4 gwm154 5AS 5/7 0/6 5 gwm639 6/18 0/10 6 gwm617 6AL 3/10 7 gwm427

20 5AS 6AS 7AS gwm635(B-) gwm154(B+) gwm130(B-) gwm60(B-)(AC-)
gwm639 (AC+) gwm617(AC-) 4,9cM gwm427(AC-) 5AL 6AL 7AL Na podstawie M.Roder,V.Kozun i inni, Genetics Society of America 1998

21 Pojedynki porastające (SR-)
Pojedynki nie porastające (SR+) LT176/10 LT522/6 AC Tm B AC B Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B i AC, otrzymany techniką SSR (gwm60-7AL).

22 Pojedynki porastające (SR-)
Pojedynki nie porastające (SR+) Tm LT522/6 B7/4/1 B7/4/5 Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B, otrzymany techniką SSR (gwm154-5AS).

23 LT522/6 Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) Tm B7/4/1 B7/4/5 Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B, otrzymany techniką SSR (gwm635-7AS).

24 LT176/10 Tm 16 Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) A9/2 Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii AC, otrzymany techniką SSR (gwm639-5AS).

25 W związku z tym, iż nie można było jednoznacznie wybrać markera odporności na porastanie w serii AC, zdecydowano się na badanie nowej populacji F2 (F408), otrzymanej przez krzyżowanie dwóch sublinii z serii A (A9/2/13 i A9/2/22) z wrażliwymi formami odmianowymi Kitaro (P2/1 i P2/24). Analiza BSA objęła 1000 starterów RAPD Wybrano 22 startery, które wstępnie weryfikowano na osobnikach, z których utworzono grupy skrajne; Po analizie obejmującą wszystkie 24 osobniki z grup skrajnych, wykryto 5 markerów RAPD.

26 Polimorfizm w pokoleniu F2
Tab.4. Startery RAPD, które potwierdziły zdolność do produkcji polimorficznych obrazów, umożliwiających rozróżnienie poszczególnych grup skrajnych roślin, wyselekcjonowanych w pokoleniu F2 (F408). Lp Nr startera Długość produktu (pz) Tm Formy rodzicielskie odporne wrażliwe Polimorfizm w pokoleniu F2 A9/2/13 A9/2/22 P2/1 P2/24 SR+ SR- 1. 651 640 1 7/12 1/12 650 5/12 9/12 2. 368 900 4/12 8/12 3. 927 400 10/12 4. 841

27 Poszukiwanie markerów wysokiej liczby opadania FN w pokoleniu F2 (F408)
Analiza BSA objęła 1000 starterów RAPD Wybrano 25 startery, które wstępnie weryfikowano na osobnikach, z których utworzono grupy skrajne; Po analizie obejmującą 19 osobników z grup skrajnych, wykryto 15 markerów RAPD.

28 z wysoką liczbą opadania Polimorfizm w pokoleniu F2
Tab.5. Startery RAPD, które potwierdziły zdolność do produkcji polimorficznych obrazów, umożliwiających rozróżnienie poszczególnych grup skrajnych roślin („FN+” i „FN-”), wyselekcjonowanych w pokoleniu F2 (F408). Lp. Nr startera Długość produktu (pz) Tm Formy rodzicielskie z wysoką liczbą opadania niską liczbą opadania Polimorfizm w pokoleniu F2 A9/2/13 A9/2/22 P2/1 P2/24 FN+ FN- 1. 972 500 1 8/8 6/11 2. 320 300 3. 664 7/8 5/11 1000 4/8 7/11 4 428 800 10/11 5/8 5. 442 1200 6. 366 1500 9/11 7. 598 2/8 8. 612 700 9. 917 6/8 10. 951 450 8/11 11. 900 12. 609 13. 1083

29 5 markerów RAPD wyselekcjonowanych w pokoleniu F2
WERYFIKACJA MARKERÓW UZYSKANYCH W POKOLENIU F2 (F408) W POKOLENIU F3 MIESZAŃCA (F408): PORASTANIE (SR) LICZBA OPADANIA (FN) 5 markerów RAPD wyselekcjonowanych w pokoleniu F2 15 markerów RAPD wyselekcjonowanych w pokoleniu F2 WERYFIKACJA 3 markery RAPD pomyślnie zweryfikowane w pokoleniu F3 8 markerów RAPD pomyślnie zweryfikowanych w pokoleniu F3

30 Polimorfizm w pokoleniu F2 Polimorfizm w pokoleniu F3
Tab.6. Weryfikacja markerów RAPD odporności na porastanie. Segregacja w obrębie osobników nie porastających (SR+) i porastających (SR-), pokolenia F2 i F3. Lp Nr startera Długość produktu (pz) Tm16 Formy rodzicielskie nie porastające porastające Polimorfizm w pokoleniu F2 Polimorfizm w pokoleniu F3 A9/2/13 A9/2/22 P2/1 P2/24 SR+ SR- 1. 651 640 1 7/12 1/12 6/13 1/13 650 5/12 9/12 7/13 11/13 2. 368 900 4/12 8/12

31 Tab. 7. Weryfikacja markerów RAPD wysokiej liczby opadania
Tab.7. Weryfikacja markerów RAPD wysokiej liczby opadania. Segregacja w obrębie osobników z wysoką (FN+) i niską liczbą opadania (FN-), pokolenia F2 i F3. Lp Nr startera Długość produktu (pz) Tm16 Formy rodzicielskie z wysoką liczbą opadania z niską liczbą opadania Polimorfizm w pokoleniu F2 Polimorfizm w pokoleniu F3 A9/2/13 A9/2/22 P2/1 P2/24 FN+ FN- 1. 972 500 1 8/8 6/11 10/10 8/13 2 320 300 9/10 5/13 3. 366 1500 4/8 9/11 4/10 11/13 4. 664 7/8 5/11 8/10 1000 7/11 9/13 5. 428 800 10/11 5/10 12/13 5/8 6/10 6. 442 1200

32 Pojedynki nie porastające (SR+)
Pojedynki porastające (SR-) W A9/2/13 Tm16 A9/2/22 P2/24 P2/1 Różnice między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych w obrębie pokolenia F2 (F408), otrzymany techniką RAPD (pr651/640 i 650pz).

33 Pojedynki nie porastające (SR+)
Tm 16 A9/2/13 P2/1 P2/24 Pojedynki porastające (SR-) Różnice między grupami skrajnymi (SR+) i (SR-), pokolenia F3, ujawnione przy użyciu startera 651/640pz i 650pz.

34 Pojedynki z wysoką liczbą opadania (FN+)
Pojedynki z niską liczbą opadania (FN-) Tm16 A9/2/13 A9/2/22 P2/1 P2/24 Różnice między grupami skrajnymi (FN+) i (FN-), pokolenia F2, ujawnione przy użyciu startera 972/500pz.

35 P2/24 Pojedynki z wysoką liczbą opadania (FN+) Tm16 A9/2/13 A9/2/22 P2/1 Pojedynki z niską liczbą opadania (FN-) Różnice między grupami skrajnymi (FN+) i (FN-), pokolenia F3, ujawnione przy użyciu startera 972/500pz.

36 Efekty poszukiwań markerów porastania w pierwotnych liniach introgresywnych Tc/Tm, nie pozwalają na sformowanie jednoznacznych wniosków. Wykryte markery nie potwierdziły swojego związku z porastaniem w rekombinantach F2. Przyczyny zaistniałej sytuacji mogą być następujące: Cecha odporności na porastanie u pszenżyta ma podłoże wielogenowe (dlatego trudno jest otrzymać jeden decydujący marker, różnicujący formy wrażliwe od odpornych i odwrotnie); PODSUMOWANIE Nie wszystkie fragmenty pochodzące od T. monococcum, obecne u linii introgresywnych Tc/Tm, niosą geny odporności na porastanie; Stopniowa eliminacja fragmentów lub całych odcinków introgresywnych w kolejnych pokoleniach krzyżowań.

37 W pokoleniu F2 , będącym potomstwem linii introgresywnej Tc/Tm serii A i wrażliwą formą uprawną, zidentyfikowano 5 markerów związanych z odpornością na porastanie (SR) i 15 związanych z wysoką liczbą opadania (FN). PODSUMOWANIE Wyselekcjonowane markery, pomyślnie zweryfikowane w obrębie pokolenia F3 (F408), 3 mające związek z odpornością na porastanie i 8 z wysoką liczba opadania, mogłyby by zostać wykorzystane do selekcji roślin odpornych od wrażliwych i o niskiej aktywności α-amylazy w obrębie dalszych pokoleń analizowanego mieszańca.