Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Aktinoryza i jej znaczenie. Aktinoryza to symbioza pomiędzy wiążącym azot promieniowcem z rodzaju Frankia oraz korzeniami niektórych drzew i krzewów okrytonasiennych.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Aktinoryza i jej znaczenie. Aktinoryza to symbioza pomiędzy wiążącym azot promieniowcem z rodzaju Frankia oraz korzeniami niektórych drzew i krzewów okrytonasiennych."— Zapis prezentacji:

1 Aktinoryza i jej znaczenie

2 Aktinoryza to symbioza pomiędzy wiążącym azot promieniowcem z rodzaju Frankia oraz korzeniami niektórych drzew i krzewów okrytonasiennych. Wiązanie azotu odbywa się w aktinoryzowych brodawkach indukowanych przez Frankia na korzeniach roślin aktinoryzowych. Wiązanie azotu przez rośliny aktinoryzowe może osiągać wydajność od 2 do 360 kg N/ha/rok co jest.porównywalne z wydajnością tego procesu u roślin motylkowych żyjących w symbiozie z Rhizobium. Azot związany przez Frankia jest dostarczany roślinie-gospodarzowi, a także jest wydzielany do gleby, dzięki czemu uzupełnia niedobory azotu. Aktinoryza jest procesem ważnym w gospodarce leśnej i w procesie rekultywacji gleby.

3 Rośliny aktinoryzowe – makrosymbiont Frankia tworzy symbiozę z ok. 220 gatunkami dwuliściennych roślin okrytozalążkowych należących do 23 rodzajów i 8 rodzin (m.in. Casuarinaceae, Myricaceae, Eleagnaceae, Rhamnaceae, Betulaceae ). Najważniejszą rośliną aktinoryzową w Polsce jest olsza Alnus sp.

4

5 Przykłady roślin aktinoryzowych, innych niż olsza: Casuarina (Australia)

6 Woskownica ( Myrica ; ang.: bayberry) Oliwnik ( Eleagnus )

7 Olsza, podobnie jak inne gatunki aktinoryzowe, należy do tzw. roślinności pionierskiej; zasiedla tereny ubogie w azot jak gleby piaszczyste, żwirowate, mokradła, nieużytki, gleby zdegradowane. Sugeruje się użycie tej rośliny jako rotacyjnej, poprawiającej jakość gleby, lub jako domieszkę w lasach składających się z drzew szczególnie ważnych z ekonomicznego punktu widzenia (sąsiedztwo olszy korzystnie wpływa na wzrost innych drzew). Przykład:

8 Frankia – mikrosymbiont Frankia jest Gram-dodatnim, powoli rosnącym, tlenowym promieniowcem o strzępkach podzielonych poprzecznymi przegrodami. Grzybnia promieniowca tworzy charakterystyczne terminalne zgrubienia, zwane pęcherzykami. Pęcherzyki otoczone są wielowarstwową ścianą zbudowaną z lipidów. Kształt pęcherzyków jest zależny od żywiciela. U Alnus mogą być kształtu buławkowatego, pałeczkowatego lub sferycznego. Wewnątrz pęcherzyków odbywa się wiązanie azotu.

9 Schemat budowy przykładowego pęcherzyka (za Małek, 1993):

10 Obok grzybni i pęcherzyków Frankia tworzy sporangia z nieruchliwymi sporami. Sporangia mogą być okrągłe lub nieregularne, a także wielokomorowe, podzielone przegrodami poprzecznymi i podłużnymi.

11 Wewnątrz brodawek olszy, jak i w czystej kulturze, Frankia może tworzyć wszystkie trzy struktury morfologiczne: grzybnię, pęcherzyki i sporangia (pęcherzyki nie powstają w pożywkach zawierających azot związany; znane też są brodawki Sp(-) nie zawierające spor lub jedynie nieliczne spory). W brodawkach pęcherzyki występują w skupieniach, tzw. vesicle clusters.

12 Pierwsza publikacja o izolacji Frankia z korzeni Alnus glutinosa w Polsce:

13 Uzyskany szczep Frankia, wykazywał wszystkie cechy typowe dla symbiontów aktinoryzowych:,

14 .....z tworzeniem sporangiów, pęcherzyków oraz ich skupisk (vesicle clusters):

15 Proces brodawkowania Sposoby infekowania korzeni roślin przez Frankia są zależne od gatunku gospodarza. U olszy w kontakcie z Frankia następuje skręcanie włośników i ich deformacja. Frankia namnaża się wewnątrz włośników i otacza tkanką rośliny-gospodarza. Namnażanie się wewnątrz korzenia zbiega się w czasie z wytwarzaniem komórek miękiszu korowego, co uwidacznia się nabrzmieniami na korzeniach, zwanych przedbrodawkami. Wskutek dalszego rozwoju brodawek tworzą się pierwotne płaty brodawkowe; są to zmodyfikowane korzenie boczne.

16 Przekrój podłużny przez płat brodawki Casuarina, zabarwiony floroglucynolem. Widoczne są silnie zabarwione, zlignifikowane strefy infekcji przez Frankia [wg R. H. Berga, cyt. za Bensonem (2008)] Aktinoryzowe brodawki są strukturami wieloletnimi (3-10 lat) z rocznym cyklem wzrostu i starzenia się. Najmłodsza, najbardziej aktywna tkanka jest zlokalizowana na obrzeżach płata brodawki. Brodawki olszy są zwarte; mogą osiągać znaczną wielkość (do kilku cm średnicy).

17 Przykłady brodawek różnych gatunków olszy:

18

19 Cytologia i ultrastruktura brodawek: Pęcherzyki sferyczne w komórkach brodawek olszy Silniejsze powiększenie przekroju brodawki olszy; widać septy w pęcherzykach

20 Brodawki u różnych roślin aktinoryzowych (kolejno od lewej): Casuarina glauca, Alnus incana subsp. rugosa, Casuarina sp., Morella pensylvanica Efektywność brodawkowania i wiązania azotu atmosferycznego jest uzależniona od wielu czynników środowiskowych (może być osłabiona przez nadmiar azotu nieorganicznego, suszę, obniżenie temperatury, zbyt niskie pH, brak fosforu i innych biopierwiastków, nieobecność innych drobnoustrojów ryzosferowych). Proces brodawkowania znajduje się pod kontrolą czynnika hormonalnego (istotne znaczenie mają zwłaszcza auksyny i cytokininy).

21 Wiązanie azotu Frankia wiąże azot w pęcherzykach symbiotycznych. Pęcherzyki zawierają enzym FeMo nitrogenazę. Jest on nieodwracalnie inaktywowany przez tlen u wszystkich organizmów wiążących azot atmosferyczny. Uważa się, że u Frankia ściana komórkowa pęcherzyków chroni enzym przed inaktywującym działaniem tlenu. Azot związany w symbiozie aktinoryzowej jest przenoszony do rośliny jako NH 3 / NH 4 +. NH 3 może być toksyczny, jeśli zostaje zakumulowany. Jednak w obojętnym pH komórki szybko przechodzi w NH 4 + i jest asymilowany przez roślinę drogą: syntaza glutaminianowa – glutaminiano-oxo-glutarowy system aminotransferaz. W reakcjach transaminacji powstaje cytrulina, najważniejszy związek azotowy transportowany w ksylemie rośliny.

22 Mechanizmem pozyskiwania energii wewnątrz brodawek jest hydrogenaza. Aktywność nitrogenazy w brodawkach korzeniowych jest uzależniona od aktywności fotosyntezy w liściach, co sugeruje ścisły związek obu procesów. Przypuszcza się, że molibden w cząsteczce nitrogenazy, w warunkach in vitro może być zastąpiony przez wanad, mangan lub chrom. Podstawowe reakcje wiązania azotu przez Frankia, można wg Bensona (2008) przedstawić następująco (vide nast. przeźr.):

23 Frankia, podobnie jak i inne bakterie diazotroficzne, wytwarza hydrogenazę, która umożliwia odzyskanie części elektronów – straconych wskutek produkcji H 2 przez nitrogenazę (Benson, 2008).

24 Dzięki efektywnemu wiązaniu azotu przez Frankia, rośliny aktinory- zowe są organizmami pionierskimi – mogącymi zasiedlać środowis- ka skrajnie ubogie w azot:

25

26 Poprawę wzrostu siewek olszy na podłożach bezazotowych, można uzyskać nie tylko w drodze szczepienia czystą kulturą Frankia – ale także zawiesiną zmiażdżonych brodawek:

27 Szczepienie Frankia, umożliwia wykorzystywanie przez roślinę- gospodarza biopierwiastków zawartych w skałach takich, jak bazalt – wskutek wietrzenia skał:

28 Izolowanie Frankia Frankia występuje najliczniej w glebach porośniętych brodawkującymi roślinami aktinoryzowymi, ale promieniowca znajdowano także w glebach pozbawionych roślin żywicielskich (w tym także w środowiskach ekstremalnych, jak gleby zasolone, kwaśne, mokradła, wydmy). Liczebność Frankia w glebie określa się pośrednio przy użyciu metody brodawkowania. Bezpośrednie izolacje Frankia z gleby bardzo rzadko kończą się sukcesem. Zazwyczaj Frankia izoluje się z brodawek korzeniowych. Istnieją trzy główne przyczyny, z powodu których izolacja i hodowla są utrudnione: (1) długi czas wzrostu Frankia, (2) specyficzne wymagania odżywcze, (3) obecność innych mikroorganizmów w brodawkach. Pozycja taksonomiczna Frankia wg Bensona (2008):

29

30 Znane są następujące metody izolowania Frankia : - seryjnych rozcieńczeń, - mikrosekcji, - selektywnej inkubacji, - wirowania w gradiencie sacharozy, - filtracji. Metoda filtracji Bensona (1982) jest uważana za najbardziej wydajną procedurę izolacji. Opiera się na stwierdzeniu, że skupienia pęcherzyków (vesicle clusters), uwolnione z tkanek brodawki w trakcie ich homogenizacji, mają około 20-50 μm średnicy. W czasie filtracji tkanki brodawek zatrzymują się na filtrze o porach 50 μm, a skupienia pęcherzyków na 20 μm oczkach.

31 Dr David R. Benson, Professor of Microbiology, Department of Molecular & Cell Biology U-3125, University of Connecticut, Storrs, CT 06269-3125, Phone: 860-486-4258, e-mail: david.benson@uconn.edudavid.benson@uconn.edu

32 Mikroorganizmy inne niż Frankia zostają oddzielone od pęcherzy- ków w trakcie przemywania sterylną wodą destylowaną. Materiałem zebranym z filtra o porach 20 μm szczepi się bezazotowe pożywki dla Frankia. Po 4-8 tygodniach inkubacji w temperaturze 25-30 C można zaobserwować charakterystyczny dla promieniowców wzrost. Izolaty zalicza się do Frankia na podstawie 5 kryteriów: 1. morfologia (wytwarzanie pęcherzyków i sporangiów) 2. budowa chemiczna ściany komórkowej i błon komórkowych 3. serologia 4. homologia DNA 5. infekcyjność i / lub efektywność w symbiozie z rośliną żywicielską.

33 Uproszczone kryteria dotyczą morfologii, zdolności wiązania azotu oraz zdolności do infekcji roślin żywicielskich i tworzenia efektywnych symbioz. =================================================== Przykładowe hodowle wytrząsane Frankia – w kolbach – bez (po lewo) i z dodatkiem polimeru Carbopol (po prawo):

34 Część praktyczna

35 Materiał : brodawki korzeniowe olszy czarnej Alnus glutinosa, wiążący azot szczep Azospirillum (kontrola pozytywna) Badanie aktywności nitrogenazy w brodawkach (metodą redukcji acetylenu): - - do badania użyć świeżych brodawek, - -- oddzielić poszczególne płaty brodawek i umieścić w trzech probówkach o pojemności 12 cm 3 po 3,5 g lub - w przypadku mniejszej ilości materiału- w probówkach o pojemności 2,5 cm 3 po 0,8 g (brodawki wypełniają probówkę do połowy jej wysokości), - - probówki zamknąć szczelnie gumowymi, sterylnymi korkami "serum stopper", - - w jednej z trzech probówek sprawdzić wolną pojemność probówki (wlewając do brodawek ilościowo wodę "pod korek" przy użyciu

36 pipety szklanej o pojemności 10 cm 3 ) - z dwóch pozostałych probówek usunąć strzykawką powietrze i wprowadzić acetylen (nową strzykawką) tak, aby stanowił on 10% całkowitej wolnej pojemności probówki, - po 2 godz. inkubacji w temperaturze 30 C pobrać z probówek 1 ml (lub 0,2 ml) próbki gazowe i zbadać w nich zawartość etylenu przy użyciu chromatografu gazowego (kolumna o wymiarach 2 m x 1,8 mm wypełniona Porapak R, 80-100 mesh, temperatura kolumny 70 0 C, dozownika i detektora 100 0 C, gaz nośny azot z przepływem 40 cm 3 /min, detektor FID), - zanalizować dane przy użyciu programu komputerowego: "Chrom-Anal", - obliczyć wg wzoru Martennsona ilość nm etylenu/próbkę/godz, a następnie przeliczyć ilość etylenu na 1 g świeżej masy brodawek:

37 A= % C 2 H 4 /100 x [(PV/RT) x 10 9 ] / t A - aktywność nitrogenazy (nm C 2 H 4 /próbkę/godz), % C 2 H 4 - % powierzchni piku etylenu z chromatografu gazowego, P- ciśn. atmosferyczne (~ 1,0 atm) V- objętość acetylenu (C 2 H 4 ) wstrzykniętego do probówki (ml), R- stała gazowa = 82,054 ml x atm/mol/ K, T - temperatura w stopniach Kelvina (273 + C) t - czas inkubacji próbki z acetylenem. (Schemat badania – poniżej)

38

39 2. Badanie wiązania azotu przez szczep Azospirillum : - - do badania użyć szczepu wyhodowanego w bezazotowej pożywce Rennie (pożywka nie zaszczepiona będzie stanowiła "ślepą próbę"), - - zastąpić korek z waty na sterylny "serum stopper", - - z probówki za pomocą strzykawki usunąć 0,7 cm 3 powietrza (10%) znad pożywki i dodać taką samą ilość acetylenu, - - inkubować hodowlę w 30 C przez 2 godz. (lub dłużej) - - do dozownika chromatografu gazowego wstrzyknąć 1 cm 3 próbki gazowej pobranej znad pożywki, zbadać w próbce zawartość etylenu, - aktywność nitrogenazy wyrazić w nmolach etylenu/hodowlę/godzinę wg wzoru Martennsona.

40 3. Izolowanie Frankia metodą filtracji Bensona - - oddzielone płaty brodawek przepłukać pod bieżącą wodą - - przeprowadzić powierzchniową sterylizację brodawek używając 2,5% podchlorynu sodu (zastosować preparat Ace w rozcieńczeniu 1:1, do rozcieńczenia użyć sterylnej wody destylowanej), do podchlorynu dodać kroplę Tween 20, brodawki wytrząsać na mieszadle magnetycznym przez 25 min., (schemat – poniżej): l

41 Czas 25-minutowego mieszania brodawek przy sterylizacji powierz- chniowej brodawek – proszę wykorzystać na liczenie kolonii na płytkach z ćwiczenia 2!

42 - brodawki przepłukać 5-krotnie niewielką ilością wody sterylnej, - w sterylnych warunkach pociąć brodawki na bardzo drobne kawałki, odrzucając wierzchołki, - przeprowadzić homogenizację skrawków brodawek w sterylnym, szklanym homogenizatorze w niewielkiej ilości sterylnej wody, - filtry o porach 50 i 20 μm wysterylizować 1% podchlorynem sodu - 1 min., po czym kilkakrotnie przepłukać sterylną wodą, - homogenat przefiltrować przez oba filtry stosując do przepłukiwania duże ilości sterylnej wody, - materiał z filtra o porach 20 μm, będący właściwym inokulum, przenieść do sterylnej probówki, - sprawdzić obecność pęcherzyków Frankia ("vesicle clusters")

43 w zawiesinie pod mikroskopem, - uzyskaną zawiesiną zaszczepić 10 probówek z bezazotową pożywką dla Frankia.

44 Główne źródło ilustracji i innych informacji: Benson D.R., 2008: Frankia & Actinorhizal Plants. Copyright D. R. Benson, Department of Molecular & Cell Biology, University of Connecticut, Storrs, CT 06269-3125. http://web.uconn.edu/mcbstaff/benson/Frankia/FrankiaHome.htm# (19.X.2008)

45 Literatura 1.Akkermans A.D.L., Hafeez Z., Roelofsen W., Chaudhary A.N., 1984. Ultrastructure and nitrogenase activity in pure culture and in actinorhizas of Alnus, Colletia and Datisca spp. [w] Advances in Nitrogen Fixation Research, red. C. Veeger, W.E. Newton, Nijhoff/Junk Pudoc, The Hague, s. 311. (cyt. za Małek, 1993) 2. Benson, D. R. 1982. Isolation of Frankia strains from alder actinorhizal root nodules. Appl. Environ. Microbiol. 44: 461-465. 3. Benson D.R., 2008: Frankia & Actinorhizal Plants. Copyright D. R. Benson, Department of Molecular & Cell Biology, University of Connecticut, Storrs, CT 06269-3125. http://web.uconn.edu/mcbstaff/benson/Frankia/FrankiaHome.ht m# (19.X.2008) http://web.uconn.edu/mcbstaff/benson/Frankia/FrankiaHome.ht m#

46 4. Dahm H., 2000. Aktinoryza i mikoryza na korzeniach olszy. Wyd. IBL i CZLP, str. 77-83. 5. Król M.J., Zielewicz-Dukowska J., 2005. Genetyczne aspekty wiązania N 2 bakterii z rodzaju Azospirillum. Post. Mikrobiol., 44 (1): 47-56. 6. Li C.Y., Bormann B.T., and Chang T.T., 2005. Restoration of degraded soil ecosystems and maintenance of long-term site productivity by actinorhizal plants. In Jamaluddin Jamaluddin (ed.) Biofertilizers. pp. 1-12. 7. Li C. Y., Strzelczyk E., and Pokojska A., 1996. Nitrogen-fixing endophyte Frankia in Polish Alnus glutinosa (L.) Gaertn. Microbiol. Res. 151 : 371-374.

47 8. Małek W., 1993. Symbioza roślin okrytozalążkowych z Frankia, promieniowcem wiążącym azot atmosferyczny. Post. Mikrobiol., 32 (4): 337-350. 9. Marcinowska K., 1997. Promieniowce wiążące azot atmosferyczny [w] Drobnoustroje w środowisku – występowanie, aktywność i znaczenie. W. Barabasz i J. Grzyb. (red.): 403-416. Wyd. AR Kraków. 10. Strzelczyk E., 2000. Znaczenie aktinoryzy dla leśnictwa. Sylwan, 144 (4): 7-15. ==================================================== Filmy (a raczej filmiki) nt. aktinoryzy i Frankia na str. D.R. Bensona: Vesicles – The Movie (monitoring hodowli Frankia ) 3-D Hyphae in Datisca cells (rekonstrukcja z mikr. konfokalnego)

48 Dziękuję za uwagę ;-)


Pobierz ppt "Aktinoryza i jej znaczenie. Aktinoryza to symbioza pomiędzy wiążącym azot promieniowcem z rodzaju Frankia oraz korzeniami niektórych drzew i krzewów okrytonasiennych."

Podobne prezentacje


Reklamy Google