Mikroskopia i techniki wizualizacji Milena Damulewicz Zakład Cytologii i Histologii Uniwersytet Jagielloński

http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/wavebasics/index.html http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/wavebasics/index.html

http://www. microscopy. fsu http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/lenses/converginglenses/index.html http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/lenses/diverginglenses/index.html

optyka

http://www. microscopy. fsu http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/lenses/converginglenses/index.html http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/lenses/diverginglenses/index.html

http://www. microscopy. fsu http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/aberrations/spherical/index.html http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/aberrations/chromatic/index.html ABERRACJA SFERYCZNA Wiązki światła symetryczne względem osi optycznej i różnie od niej oddalone, po przejściu przez układ nie przecinają się w jednym punkcie http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/aberrations/spherical/index.html

ABERRACJA CHROMATYCZNA http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/aberrations/chromatic/index.html ABERRACJA CHROMATYCZNA Wada soczewkowych układów optycznych spowodowana zależnością współczynnika załamania światła materiału soczewek od długości fali świetlnej; przejawia się w powstawaniu na obrazie barwnych obwódek wskutek rozszczepienia światła przy załamaniu w materiale soczewki. http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/aberrations/chromatic/index.html

http://www. microscopy. fsu. edu/primer/java/aberrations/coma/index http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/aberrations/coma/index.html KOMA Wiązka promieni świetlnych, wychodząca z punktu położonego poza osią optyczną, tworzy po przejściu przez układ plamkę w kształcie przecinka; ujawnia się tym bardziej, im dalej punkt leży od osi. http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/aberrations/coma/index.html

http://www. microscopy. fsu http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/aberrations/astigmatism/index.html Astygmatyzm Obraz punktu położonego poza osią optyczną układu nie tworzy punktu, lecz dwie linie ogniskowe, z których jedna leży w płaszczyźnie padania, obejmującej oś soczewki i  przedmiot punktowy, a druga jest do tej płaszczyzny prostopadła. http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/aberrations/astigmatism/index.html

http://www. microscopy. fsu http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/microscopy/transmitted/index.html http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/kohler/condenseraperture/index.html http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/microscopy/transmitted/index.html http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/kohler/condenseraperture/index.html

http://www. microscopy. fsu http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/microscopy/transmitted/index.html http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/microscopy/transmitted/index.html

Zdolność rozdzielcza mikroskopu NA NA = n sinm

http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/nuaperture/index.html http://www.microscopy.fsu.edu/primer/java/nuaperture/index.html

L – mechaniczna długość tubusa Powiększenie mikroskopu L D M = f1 f2 L – mechaniczna długość tubusa D – odległość dobrego widzenia (250 mm) f1 – ogniskowa obiektywu f2 – ogniskowa okularu

Przysłona aperturowa

Typy mikroskopów Mikroskop świetlny Fluorescencyjny Elektronowy Jasnego pola Ciemnego pola Kontrastu fazowego Interferencyjny Polaryzacyjny Fluorescencyjny Elektronowy Skaningowy transmisyjny Konfokalny

Mikroskop jasnego i ciemnego pola www.precoptic.pl

Mikroskop interferencyjny Kontrast Nomarskiego Analiza ilościowa suchej masy Określenie grubości skrawków Optyczne „wybarwienie” Plastyczny obraz

Mikroskop fluorescencyjny Filtr wzbudzenia Filtr absorbujący Filtr barierowy

Mikroskop konfokalny

Mikroskop elektronowy skaningowy

TEM

Metody wizualizacji Barwienie przyżyciowe Barwienie histologiczne Barwienie histochemiczne Barwienie immunohistochemiczne Barwienie fluorescencyjne Barwienie immunofluorescencyjne Barwienie radioimmunoizotopowe Barwienie enzymatyczne GFP

Przygotowanie materiału Preparaty parafinowe Utrwalenie tkanek – formalina Odwodnienie Przepojenie Zatopienie w parafinie Skrawanie Odparafinowanie Nawodnienie barwienie Preparaty mrożeniowe Krioprotekcja Utrwalenie w ciekłym azocie Skrawanie barwienie

Barwienie histologiczne Kontrastowanie struktur komórkowych Hematoksylina + eozyna fiolet krystaliczny

Barwienie histochemiczne Uwidocznienie określonych substancji w komórce PAS = z odczynnikiem Schiffa – wykrywa cukry

Barwienie immuno- Przeciwciało drugorzędowe znacznik Przeciwciało Przeciwciało pierwszorzędowe

Barwienie immunohistochemiczne Wykrywanie antygenów za pomocą znakowanych przeciwciał

Barwienie radioimmunoizotopowe Tryt Jod 125 Fosfor 32 Fosfor 33 Siarka35 Węgiel 14

Barwienie enzymatyczne Peroksydaza chrzanowa Alkaliczna fosfataza

Barwienie fluorescencyjne DiIC18 – błona komórkowa Hoechst –DNA – niebieskie   DAPI Oranż akrydyny – DNA zielone; RNA pomarańczowe

Barwienie immunofluorescencyjne FITC Texas red Cy3 rodamina

GFP www.greenspine.ca/en/GFP_neuron.html

Oświetlenie Kohlera Kondensor przesuwamy pod stolik Ustawiamy ostro widziany preparat Zamykamy przesłonę polową i aperturową Ustawiamy na środku plamkę światła Ustawiamy ostre brzegi plamki Rozszerzamy plamkę do granic pola widzenia Ustawiamy włókna żarówki centralnie