pomiar NMR spektroskopia impulsowa Wykład 9 pomiar NMR spektroskopia impulsowa

Pomiar widma NMR N warunek rezonansu: n = gB / 2p E = ħB h Historyczna metoda fali ciągłej pomiaru widma NMR: — przemiataniu częstością pomiar absorpcji promieniowania radiowego przy zmianie częstości Jądra znajdujące się w różnych otoczeniach chemicznym po kolei spełniają warunek rezonansu. — przemiataniu polem przy stałej częstości Metoda bardzo powolna. Współcześnie tej metody się nie stosuje. Pozostały określenia „górno-, dolnopolowe przesunięcie” S próbka umieszczona w polu magnetycznym

Wymagania stawiane widmu NMR: S/N = 2,5 H/h H dobra czułość ~ B02, g3; zawartość izotopu, stężenie Akumulacja n widm  sygnał rośnie n razy, szum – n1/2 razy; poprawa S/N: n1/2 Warunki pomiaru muszą być takie same. Niezbędne jest wykonanie wielu widm (i to szybko). dobra rozdzielczość rozdzielczość - zdolność spektrometru do rozdzielenia blisko leżących sygnałów; minimalna różnica częstości dla jakiej można obserwować oddzielne sygnały. Jeśli 2 linie są w odległości mniejszej niż ich szerokości połówkowe, następuje całkowite zlanie. Wysoka rozdzielczość w NMRze 0,1-0,5 Hz. Wysoka rozdzielczość nakłada na pomiar wymaganie długiego czasu pomiaru, bo z zasady nieoznaczoności Heisenberga: DE Dt  h Dn Dt  1 h 3n1/2 1.1n1/2 0.9n1/2 1 Hz 1 sek = 1 pomiar z szybkością max. 1 Hz na 1 sek. 1000 Hz szerokości spektralnej mierzy się przez ponad 15 minut. Polepszenie S/N 2 razy daje pomiar 4 razy - 1 godzina! n1/2 mała duża

Metoda impulsowa w spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego od lat 70. XX w. Polega na wzbudzaniu jednocześnie wszystkich częstości jednym impulsem o częstości radiowej, zbieraniu odpowiedzi w domenie czasu (jednocześnie całego zakresu) a następnie konwertowanie jej do pożądanego widma — zależności od częstości w procesie transformacji Fouriera (FT). FID czas transformacja Fouriera widmo NMR czestotliwość

Klasyczny opis zjawiska NMR użyteczny przy rozpatrywaniu technik impulsowych opis klasyczny: Jądro magnetyczne traktowane jest jako dipol magnetyczny; B0 „usiłuje” ustawić go zgodnie z kierunkiem B0, ale własny moment pędu jądra wywołuje ruch precesyjny wektora m, precesję Larmora. Odpowiednikiem 2 stanów spinowych są - równoległa i antyrównoległa orientacja składowej Z momentu magnetycznego m względem zewnętrznego pola B0. B0 opis kwantowy: Bo E DE = hn mI = + 1/2 mI = - 1/2

Precesja Larmora; model wektorowy Blocha Prędkość kątowa tego ruchu precesyjnego w polu B0 wynosi 0 = - gB0 [rad/sekunda] (dla momentu m = gp) częst. n = - gB0 /2p [Hz] i nazywa się częstotliwością Larmora Absorpcja energii, hn, prowadzi do inwersji wektora m (zmiana stanu spinowego). Oscylujące pole B1 w płaszczyźnie XY może powodować odwrócenie wektora m. Felix Bloch g decyduje o kierunku ruchu Składowa XY magnetyzacji wynosi zero. Bo nie ma spojności w ruchu precesyjnym momentów. Czyli fazy ich ruchu są różne. znak g oznacza kierunek precesji

Próbka makroskopowa, namagnesowanie Namagnesowanie próbki M0, magnetyzacja wypadkowa indywidualnych momentów jądrowych jąder stanowiących nadmiar w stanie podstawowym. Nadmiar określony rozkładem Boltzmana (Na/Nb = eDE / RT) Wektor wypadkowej magnetyzacji (makroskopowa) zachowuje się zgodnie z zasadami fizyki klasycznej, uproszczony opis nazywa się modelem wektorowym Blocha. M0 x y z nadmiar w stanie podstawowym g decyduje o kierunku ruchu Składowa XY magnetyzacji wynosi zero. Bo nie ma spojności w ruchu precesyjnym momentów. Czyli fazy ich ruchu są różne. próbka = duży zbiór wektorków Rys. z T. D. W. Claridge, High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry,

Fala radiowa, B1; rotujący układ współrzędnych Oscylujące pole magnetyczne B1 (wzdłuż osi x): Laboratoryjny układ współrzędnych: Rotujący z częstością Larmora układ współrzędnych: Składowa XY magnetyzacji wynosi zero. Bo nie ma spojności w ruchu precesyjnym momentów. Czyli fazy ich ruchu są różne. Przyłożenie impulsu promieniowania elektromagnetycznego o częstości radiowej równej częstości Larmora o w kierunku osi x laboratoryjnego układu współrzędnych spowoduje pojawienie się w wirującym z częstością Larmora układzie współrzędnych statycznego pola B1 wzdłuż kierunku osi x′. pole B1 oscylujące (no) pole B1 statyczne obraz statyczny, ruch precesyjny zamrożony Rys. z T. D. W. Claridge, High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry,

Laboratoryjny układ współrzędnych porusza się obserwator Laboratoryjny układ współrzędnych pozornie nieruchomy obserwator Rotujący układ współrzędnych Ten rys. i następne z T. D. W. Claridge, High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry,

Impuls; zgodność faz  = g B1 t [radiany] rotujący układ współrzędnych Impuls - pole B1 (promieniowanie radiowe) działające przez b. czas (krótki) t Działanie impulsu: F = Mo x B1  obrót tego wektora o kąt  = g B1 t [radiany] przed: po: Tuż po impulsie: Mx = 0, My = Mo sin Mz = Mo cos pomiar reguła prawej ręki Przyłożenie impulsu promieniowania elektromagnetycznego o częstości radiowej równej częstości Larmora o w kierunku osi x laboratoryjnego układu współrzędnych spowoduje pojawienie się w wirującym z częstością Larmora układzie współrzędnych statycznego pola B1 wzdłuż kierunku osi x′. zrównanie polulacji - jąder wzbudzonych i nie wzbudzonych zrównanie populacji inwersja populacji max. magnetyzacja w y zerowa w z Po impulsie 90° poszczególne spiny przerzucone są w stronę +y, są spójne w fazie

Impuls 90o i 180o, nasycenie Impuls 90- stopniowy, albo nasycenie Impuls 180- stopniowy - inwersja populacji. Nasycenie sygnału - zrównanie populacji spinów a i b z jednoczesnym brakiem spójności fazy – ze statystycznym rozłożeniem w płaszczyźnie XY. MXZ = 0 Pomiar sygnału w płaszczyźnie XY, stąd impuls 90 i 270-st. daje maksymalną intensywność sygnały mierzonego, 180 i 360 - zerową.

Pomiar sygnału. Swobodny spadek indukcji, FID Rotacja M w płaszczyźnie xy (układ lab.) indukuje w odbiorniku słaby sygnał elektromagnetyczny, który mierzymy. sygnał maleje ekspotencjalnie (procesy relaksacyjne) FID Free Induction Decay M czas x y transformacja Fouriera odbiornik w płaszczyźnie xy (detekcja kwadraturowa) widmo częstotliwość linia na widmie ma kształt krzywej Lorentza

Transformacja Fouriera, FT Przedstawienie częstości w dwojaki sposób: Czas i częstość są ze sobą związane: n n = 1 / Dt Dt Jeśli nakładają się setki różnych częstości prosta ekstrakcja częstości nie jest możliwa.

FT domena czasu domena częstości 4. złożenie wielu częstotliwości 3. dwie częstotliwości FT FT 2. większa częstotliwość FT 1. mniejsza częstotliwość

Faza sygnału rotujący układ współrzędnych Kierunek działania impulsu a faza sygnału w widmie x y z 90oy B1 Mo 90o-x krzywa dyspersyjna x y z 90ox B1 Mo Faza sygnału ta sama częstość i amplituda, różna faza część rzeczywista część urojona FT skutek w kształcie linii krzywa dyspersyjna

Parametry akwizycji danych częstość podstawowa NS 16 RG 280

Czasy związane z pomiarami szerokość (czas) impulsu np. impuls 90o (p/2), czas t90 p1 d1 zwłoka relaksacyjna, czas oczekiwania czas akwizycji aq czas repetycji sekwencji czas opóźnienia akwizycji

Długość trwania impulsu i zasada nieoznaczoności Dn Dt  1 n0 D impuls selektywny, wzbudzający tylko niektóre częstości pod warunkiem że impuls ma wystarczającą moc. Warunkiem wzbudzenia wszystkich jąder z zakresu  (np. 10 kHz dla 1H) jest aby B1 >> 2  Krótki impuls - wykorzystuje tę zasadę na naszą korzyść - monochromatyczny impuls wzbudza szeroki zakres częstości: od n = n0 - 1/t do n = n0 +1/t warunek wzbudzenia takiego zakresu częstości : gB1 >> 2pD (D – szer. spektralna) gdzie t - szerokość impulsu (czas). Impuls musi także mieć dostatecznie dużą moc.

Długość trwania impulsu i zasada nieoznaczoności Dn Dt  1 Aby pokryć całą wymaganą częstość, np. 10 ppm w 1H NMR na spektrometrze, np. 400 MHz, co odpowiada 4000 Hz ( 2000 Hz), potrzebujemy impulsu 0,5 ms lub krótszego. 13C NMR, 100 MHz, zakres 200 ppm ( 10000 Hz)  impuls 100 ms W praktyce impulsy są jeszcze krótsze (rzędu 10 ms). Impulsy w spektrometrze są kalibrowane (dla pożądanego kąta – czas trwania i moc), D

Czas oczekiwania, czyli czas na relaks p1 zwłoka relaksacyjna, czas oczekiwania d1 czas akwizycji aq czas repetycji sekwencji czas na powrót magnetyzacji do stanu równowagi, do osi Z (procesy relaksacji) 1H NMR – 1 sekunda; dla specjalnych pomiarów ilościowych lub pomiarów T1 – 5 sek. 13C NMR – 2 sekundy (kompromis pomiędzy żądaniem osiągnięcia relaksacji jąder i zmierzenia jak największej liczby skanów w określonem czasie) UWAGA! Czasy relaksacji wielu węgli są dłuższe! (jedna z przyczyn dla których nie ma proporcjonalności intensywności piku w 13C i ilości rezonujacych jąder)

Zasada nieoznaczoności i czas pomiaru (akwizycji) czas akwizycji aq Jakie jeszcze znaczenie ma czas? Wpływa na szerokość linii - zbyt krótki czas pomiaru sygnału (FID-u) pociąga za sobą zbyt dużą nieoznaczoność energii (~niedokładność pomiaru częstości) zgodnie z zasadą Heisenberga: DEDt ~ h/2p. Dlatego FID musi być dostatecznie długo mierzony (czas aq jest obliczany przez program na podstawie SW i liczby punktów FID-u, TD) Dn Dt  1

Zakres spektralny, SW przesunięcia chemiczne - milionowe części częstości podstawowej 10 ppm = 3000 Hz na spektrometrze 300 000 000 Hz o1p Zakres widma definiowany jest przez SW oraz połozenie środka widma, parametr o1 (o1p)

Pomiar sygnału NMR sygnał referencyjny sygnał digitalizowany sygnał NMR częstość Larmora, częstość impulsu

konwersja analogowo-cyfrowa, ADC Twierdzenie Nyquista konwersja analogowo-cyfrowa, ADC Aby prawidłowo odwzorować oscylujący sygnał analogowy musi on być opisany przez conajmniej 2 punkty pomiarowe na okres drgań. Sygnał o częstości F musi być próbkowany z częstościa conajmniej 2F. Maksymalana częstość = SW. DW = 1 / 2SW; DW = dwell time, czas pojedynczego pomiaru, odległość w czasie między punktami nie spełnia warunku zawijanie sygnału ADC ma oganiczoną szybkość - limituje częstotliwość, a w ten sposób limituje max. SW

Rozdzielczość cyfrowa FIDu, czas akwizycji Z zasady nieoznaczoności: rozdział linii odległych o Dn Hz wymaga czasu nie mniejszego od 1 / Dn sek. AQ = DW * TD = TD / 2 SW AQ - czas akwizycji DW - czas pomiaru 1 punktu TD - rozmiar FIDu (liczba punktów FIDu), (np. 65536) SW - zakres spektralny DR = SW / SI = 2 SW / TD = 1 / AQ DR - rozdzielczość cyfrowa, [Hz/pt], SI - rozmiar widma SI = TD / 2 (r+i) Dla rozdzielczości poniżej 1 Hz AQ wymagany - 2-4 s (DR = 0,5 - 0,25 Hz/pt) DW = 1 / 2SW

Rozdzielczość cyfrowa widma, dopełnianie zerami TD - rozmiar FIDu (ustalany przed pomiarem) - parametr pomiaru SI - rozmiar widma (parametr obróbki FIDu) SI = TD / 2 (ustawienie standardowe) Możliwe, a czasem niezbędne jest zwiększenie SI, poprzez dopełnianie zerami

Parametry zbierania danych - wzmocnienie odbiornika, RG intensywność sygnału zbyt duża skutek: zniekształcenie linii podstawowej FT

Liczba skanów (NS) (stosunek sygnału do szumu) Wraz ze wzrostem ilości skanów sygnał rośnie szybciej niż szum. Po n skanów szum rośnie n1/2 raza, sygnał n razy, stosunek S/N rośnie n1/2 raza.

Zakres dynamiczny Sygnał elektryczny -> binarna liczba proporcjonalna do intensywności sygnału; ilość bitów takiej liczby definiuje ROZDZIELCZOŚĆ PRZETWORNIKA ADC; typowo 16 bitów, zakres dynamiczny przetwornika: 1 - 32767, czyli stosunek sygnały najsłabszego do najmocniejszego możliwego do zarejestrowania Szum wynikający ze zbyt małego zakresu dynamicznego jeśli moc odbiornika dobierzemy tak ze najsilniejszy sygnal ma max wartosc, to najmniejszy wykrywalny sygnał ma wartosc 1. Jesli jest mniejszy to odbiornik go nie wykrywa.

Parametry obróbki widma funkcja okna 1. Manipulacje widmem przed transformacją Fouriera - dopełnianie zerami (SI) - wprowadzenie funkcji okna, parametr poszerzenia linii, LB (line broadening), manipulacja czułością i rozdzielczością poprzez przykładanie różnych wag do różnych części FIDu dominuje sygnał dominuje szum LB = 1 apodyzacja obciętego FIDu

Kształt FIDu a kształt linii rezonansowej, dopełnianie zerami (zero filling) dominuje sygnał dominuje szum FT FT funkcja okna FT FT

Kształt linii w NMRze 2 parametry: LB GB

Obróbka widm programem TopSpin 1. Przed transformacją Fouriera dobieramy następujące parametry obróbki widma 1H NMR: a) liczba punktów widma, SI; standardowo SI = TD/2, gdzie TD – liczba punktów FIDu b) parametr poszerzenia linii, LB, standardowo dla diamagnetyków LB = 0.3-0.5; (13C: 1); czasem wybieramy inny kształt linii (Gaussa) i dodatkowe parametry (GB) 2. Wykonujemy transormację Fouriera (ft, efp – expotencjalnie z zachowaniem fazy), a następnie: a) korygujemy fazę (automatycznie apk lub ręcznie), b) kalibrujemy widmo (sygnał resztkowy lub wzorzec), c) korekcja linii podstawowej przed całkowaniem. 3. Odczytywanie parametrów widma: a) odczytywanie przesunięć chemicznych (po kalibracji), peak picking, b) odczytywanie stałych sprzężenia, c) całkowanie (po korekcji linii podstawowej) integration, d) dekonwolucja 4. Porównywanie kilku; odejmowanie widm. 5. Przygotowanie wydruku. 6. Przeniesienie do edytora rysunków.

ciąg dalszy technik wieloimpulsowych Widma 2-wymiarowe Jak powstaje widmo 2-wymiarowe? ciąg dalszy technik wieloimpulsowych

Najprostszy eksperyment dwuwymiarowy (2D) COSY COrrelation SpectroscopY spektroskopia korelacyjna 1D 2D t1 t2

Drugi wymiar przygotowanie ewolucja mieszanie detekcja d1 p1 t1 p2 aq (t2) relaksacja i wzbudzenie conajmniej jednym impulsem

Drugi wymiar przygotowanie ewolucja mieszanie detekcja d1 p1 t1 p2 aq (t2) t1 jest inkrementowany cała sekencja impulsów powtarzana jest z różnymi czasami t1

Drugi wymiar wędrowanie magnetyzacji pomiędzy sprzężonymi spinami przygotowanie ewolucja mieszanie detekcja d1 p1 t1 p2 aq (t2) conajmniej jeden impuls; wytworzenie obserwowalnej magnetyzacji poprzecznej tu spiny oddziałujące ze soba skalarnie zmieniaja czestosci precesji w wyniku przeniesienia kohenrencji (spojnosci) wędrowanie magnetyzacji pomiędzy sprzężonymi spinami przeniesienie koherencji  zmiana częstości precesji

Drugi wymiar przygotowanie ewolucja mieszanie detekcja d1 p1 t1 p2 aq (t2) pomiar, czas pomiaru najczęś-ciej oznaczany t2

Drugi wymiar Widmo 2- wymiarowe: t1 t1 ??? FT (t2) FT (t1) n1 t2 n2 n2 seria FIDów dla różnych t1 seria widm 1D różnica faz i amplitudy ostateczna mapa w domenie 2 częstości

t1 rośnie od 0 z małym interwałem; wysokość piku zależy od t1 - oscyluje sinusoidalnie z częstością n. Szczyty tych pików tworzą nowy FID, nie w funkcji czasu realnego tylko w funkcji długości interwału t1. Nowy FID zanika ekspotencjalnie. tr F t1 n2 tr. Fouriera

transformacja Fouriera w t1 tr. Fouriera

typowa prezentacja