Chemia bioanalityczna Magdalena Maj-Żurawska S.R. Mikkelsen, E. Corton, „Bioanalytical chemistry”, Wiley Inc., USA, 2004 V.A. Gault, N.H. McClenaghan, „Understanding bioanalytical chemistry”, Wiley-Blackwell, UK, 2009
Treść wykładu Analiza próbek biologicznych Bioczujniki Zastosowanie chemii bioanalitycznej w diagnostyce medycznej i badaniach farmaceutycznych
Analiza próbek biologicznych Selektywne oznaczenie zawartości konkretnego związku (enzym, przeciwciało, stwierdzenie obecności lub nieobecności DNA o znanej sekwencji zasad w próbce) Scharakteryzowanie matrycy biologicznej (oszacowanie całkowitej zawartości różnych związków biologicznych) w próbce
Bioczujniki Zastosowanie związków biologicznych (enzym, DNA) jako składników części receptorowej czujników chemicznych
Scharakteryzowanie matrycy biologicznej Oszacowanie całkowitej zawartości białek i kwasów nukleinowych
Zalety: Metoda jest szybka Wady: Interferencje innych związków absorbujących przy 260 i 280 nm (np. fenol) Nie rozróżnia DNA i RNA Użyteczna dla próbek o dużej zawartości białek i kwasów nukleinowych
Kolorymetryczne i fluorymetryczne metody oznaczania Całkowite stężenie białek DNA RNA Węglowodany Wolne kwasy tłuszczowe Metody oparte na tworzeniu chromoforów lub fluoroforów podczas selektywnej reakcji chemicznej
Całkowite stężenie białek Cu2+ tworzy w środowisku alkalicznym kompleks z atomami N wiązań peptydowych z jednoczesną redukcją do Cu+. Dodany w nadmiarze ligand BCA tworzy kompleks z Cu+ o purpurowej barwie, o maksimum absorpcji przy 562 nm będący podstawą oznaczenia.
Całkowite stężenie białek (BCA) Granica wykrywalności: 0,2 mikrograma/0,01 cm3 Interferencje: kwasy, związki kompleksujące Cu (np. duże stężenie fosforanów), reduktory (np. redukujące cukry, tiole), Tris, siarczan amonu, edta, tłuszcze i fosfolipidy
Całkowite stężenie białek Znacznik reaguje z pierwszorzędowymi aminami w białku tworząc fluorofor, który wzbudza się przy 390 nm i emituje przy 475 nm. Granica wykrywalności: 10 nanogramów/0,01 cm3 Interferencje: aminy (1- i 2-rzędowe), Tris, siarczan amonu BSA – bovine serum albumin, albumina surowicy krwi wołowej
DNA
Całkowite stężenie DNA Metoda z kwasem diaminobenzoesowym: Próbka + 1 M HClO4 10 min (usunięcie puryn, uwolnienie deoksyrybozy i przekształcenie do aldehydu -hydroksylevulinylowego Dodanie kwasu 3,5-diaminobenzoesowego (DABA), 60 st.C, 30 min:
Całkowite stężenie DNA Produkt reakcji absorbuje promieniowanie z maksimum przy 420 nm Można również mierzyć fluorescencję przy 520 nm po wzbudzeniu przy 420 nm (liniowa kalibracja 10 – 500 ng total DNA – 1 – 50 mikrogramów/cm3) Reakcja jest specyficzna dla DNA, przeszkadza obecność tłuszczów, cukrów, soli i detergentów (Triton X-100). Oddziela się je od DNA przez wytrącenie w etanolu.
Całkowite stężenie DNA Inne metody fluorymetryczne Oznaczanie dsDNA w ekstraktach tkanek: – niekowalencyjne oddziaływania ze związkami interkalującymi w wodnych roztworach o obojętnym pH Związki wykazują fluorescencję w roztworach wodnych, która znacznie wzrasta po związaniu DNA. (a) wiąże się z DNA i RNA, (b) i (c) – tylko z DNA. Granica oznaczalności z użyciem (c) – 10 ng dsDNA (1 mikrogram/cm3)
Całkowite stężenie DNA Inne metody fluorymetryczne Oznaczanie ssDNA: Terb(III) Tb3+ koordynuje do nukleotydu deoksyguanozyno-5-fosforanu w środowisku o pH 6 wywołując fluorescencję przy 488 nm po wzbudzeniu przy 290 nm. Uzyskano liniową zależność fluorescencji w zakresie 1 – 10 mikrogram/cm3 ssDNA uzyskanego przez termiczną denaturację DNA z wątroby szczura.
Cząsteczki RNA zawierają zamiast tyminy - uracyl
Całkowite stężenie RNA Jedyna używana metoda polega na usunięciu puryn w 85% H2SO4 (24 h 40 st.C); powstałe rybozofosforany ulegają defosforylacji i dehydratacji tworząc furfural; po dodaniu orcinolu powstaje związek absorbujący przy 500 nm. Nie przeszkadzają białka ani DNA.
Całkowite stężenie węglowodanów W oznaczaniu cukrów posiadających grupę aldehydową wykorzystuje się reakcje redoks stosując utleniacze takie jak Cu2+ (w obecności BCA) lub Fe(CN)63- W metodach oznaczania całkowitego stężenia cukrów stosuje się mocne kwasy w celu hydrolizy oligo- i polisacharydów i ich dehydratacji do aktywnych związków jak np. furfural. Fe(CN)64- 237 nm, 1 – 30 mikrogram/cm3 492 nm, 10 – 200 mikrogram/cm3
Całkowite stężenie węglowodanów Powstaje silnie fluorescencyjny związek 2-(2-furyl)benzotiazol, ulegający wzbudzeniu przy 361 nm i emitujący przy 411 nm, zakres oznaczania: 0,5 – 6 mikrogram/cm3
Całkowite stężenie węglowodanów Polisacharydy zawierające podstawione lub niepodstawione glikole można oznaczyć stosując reakcję z jodanem (VII) sodu. Powstały produkt absorbuje przy 550 nm (max); granica wykrywalności 15 mikrogramów/cm3 wyznaczona w analizie naturalnych polisacharydów bakteryjnych z Salmonella pneumoniae
Obrazy kopiowane przez PrtSc
Wolne kwasy tłuszczowe Większość metod oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych polega na tworzeniu pochodnych i stosowaniu chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Stosowana jest metoda kolorymetryczna do oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach węglowych (C>10) w osoczu krwi. Podstawą oznaczenia jest powstanie mydeł kobaltowych wolnych kwasów tłuszczowych rozpuszczonych w chloroformie. Absorbancję mierzy się przy 435 nm. Liniowa kalibracja uzyskana dla kwasu palmitynowego ma zakres 0,1 – 1,2 mikromola/dcm3. Białka i większość metabolitów nie przeszkadza, przeszkadzają duże stężenia fosfolipidów (np. lecytyna)