Aleksander Kołodziejczyk PROTEINY - BIAŁKA Gdańsk 2011

Proteiny = makropeptydy zawierające ponad 100 reszt AA Proteiny = makropeptydy zawierające ponad 100 reszt AA. Nazwę od proteios (gr.) – pierwszorzędny, najważniejszy wprowadził w 1883 r. J. J. Bercelius. Masa cząsteczkowa protein przekracza 10 kDa (>15 kDa); średnia MM reszty statystycznego AA występującego w białku wynosi ~100 (dokładnie 110). MM reszty Gly = 57; reszt 8 AA poniżej 100, 6 ~ 100, 9 > 100. W cząsteczce białka może znajdować się 100, kilkaset, a nawet więcej reszt AA. W skład białek wchodzą głównie AA kodowane, których jest 20 (22). Ponadto występują w nich inne, tzw. AA białkowe; jest ich kilkadziesiąt. Zróżnicowanie B. pod względem ich składu i wielkości cząsteczek stwarza ogromną możliwość kombinacji, np. liczba białek zawierających w łańcuchu 150 reszt tylko kodowanych AA osiąga wartość 20150. Liczba ta odpowiednio wzrasta z uwagi na fakt, że w skład białek wchodzą również AA inne niż kodowane. Należy również wziąć pod uwagę różnorodną wielkość łańcucha białkowego: 20100 + 20101 + 20102 + 20103 + 20104 + 20105 + ......

Praktycznie liczba białek jest ograniczona do tych, które pełnią jakąś funkcję, czyli do białek potrzebnych. W komórce E. coli jest ich ~ 3 000; dawniej u ludzi szacowano ich liczbę na 100 000, ale po rozszyfro-waniu ludzkiego genomu okazało się, że jest ich „tylko” ~ 23 000. Białka stanowią: Białka pełnią funkcję:budulcową, motoryczną, katalityczną, transportową, substancji zapasowej, podstawowego składnika pożywienia (obok cukrów i tłuszczów). Połowa masy białek w organizmie człowieka odnawia się średnio w przeciągu 80 dni. B. wątroby i osocza krwi odnawiają się co 10 dni, a mięśni co kilka miesięcy.

globularne lub sferyczne, inaczej kłębuszkowe, korpuskularne Podział białek, wg A. kształtu: globularne lub sferyczne, inaczej kłębuszkowe, korpuskularne (albuminy, globuliny, gluteiny i inne) - firylarne - włókienkowate rozpuszczalne (fibrynogen, miozyna) nierozpuszczalne - skleroproteiny (kolagen, keratyna, fibroina) B. składu: - proste, inaczej proteiny lub homoproteiny są zbudowane wyłącznie reszt aminokwasów (kolagen, keratyna, albuminy, gluteiny, miozyna i inne). - złożone, inaczej proteidy zawierają oprócz reszt AA inne elementy, np. chromoproteiny, fosforoproteiny, glikoproteiny, lipoproteiny czy metaloproteiny.

- zapasowe (prolaminy, białka jaj); - szkieletowe (skleroproteiny); C. funkcji: - zapasowe (prolaminy, białka jaj); - szkieletowe (skleroproteiny); - ciała czynne (enzymy, hormony, przeciwciała); - receptory (receptory opioidowe, rodopsyna); - wykonujące prace mechaniczną (b. mięśni); - kontrolujące przepływ materii i energii(b. represorowe, czynniki wzrostu, hormon tyreotropowy); - transportowe (transferyna, hemoglobina); - ochronne (przeciwciała). D. pochodzenia: - roślinne (prolaminy, gluteiny); - zwierzęce (b. mleka, b. krwi, b. mięśni); - drobnoustrojowe (b. drożdży, b. bakteryjne, b. wirusów). E. występowania: białka mięśni, mleka, jaj, osocza, komórkowe, rybosomalne, oka, krwi i inne.

- pełnowartościowe – zawierają wszystkie AA niezbędne w potrzebnych F. wartości odżywczej: - pełnowartościowe – zawierają wszystkie AA niezbędne w potrzebnych ilościach (np. b. mięśni, jaj, ryb); - częściowo pełnowartościowe wystarczają do podtrzymywania życia, nie zapewniają prawidłowego rozwoju (np. b. roślinne – niedobór Lys); - niepełnowartościowe przyswajalne, ale niewystarczające do podtrzymywania życia, ale nie zawierają jednego lub więcej AA niezbędnych, np. w żelatynie brakuje Trp i Cys (niedobór Met, Ile, Val i Tyr); - bezwartościowe nieprzyswajalne (np. b. włosów, paznokci czy rogów).

I. Struktura pierwszorzędowa – skład i sekwencja: Strukturalna budowa białek I. Struktura pierwszorzędowa – skład i sekwencja: np. Phe-Val-Ala-Leu-Asn-................. II. Struktura drugorzędowa – kształt i forma łańcucha białkowego. III. Struktura trzeciorzędowa – kształt cząsteczki białka wynikający z wzajemnego oddziaływania grup funkcyjnych: -COO-....H3N+-; -S-S-; wiązań wodorowych i innych. IV. Struktura czwartorzędowa – dwie lub więcej cząsteczek białkowych (globin) tworzą agregaty bez wiązań kowalencyjnych.

w 20 a nawet 30% pełnią podobną funkcję biologiczną. Struktura pierwszorzędowa – skład i sekwencja Właściwości fizykochemiczne, chemiczne i biologiczne białek są determinowane składem i sekwencją AA. Podmiana jednego AA w określonym białku może spowodować dramatyczną zmianę jego właściwości. Bywa jednak i tak, że białka różniące składem AA w 20 a nawet 30% pełnią podobną funkcję biologiczną. Skład aminokwasowy wybranych białek Reszta AA Liczba reszt poszczególnych AA w cząsteczce białka lizozym drobiowy cytoch- rom c H ferredo- ksyna lipotro- pina b owcza insulina wołowa   Średnia zawartość w statystycznym białku [%] Hemo- globina b H Ala 12 6 9 13 3 21 9,0 Gly 12 13 6 8 4 7 8,7 Ile 6 8 4 1 4,6 Met 2 3 1,7 Trp 6 1 1,1

Większość AA białkowych nie ma chromoforu, dlatego Oznaczanie składu AA białek Większość AA białkowych nie ma chromoforu, dlatego w celu detekcji przeprowadza się je w barwne pochodne, często za pomocą ninhydryny. Chromatogram rozdzielonych aminokwasów kodowanych Do wykrywania barwnych pochodnych wykorzystywane są detektory UV/Vis.

N-terminalny AA można też oznaczyć za pomocą aminopeptydazy, Pochodne AA powstające w reakcji z aldehydem o-ftalowym lub chlorkiem dansylu wykrywane są za pomocą znacznie czulszych detektorów fluorescencyjnych. Oznaczanie N-terminalnego AA N-terminalny AA można też oznaczyć za pomocą aminopeptydazy, czyli enzymu hydrolizującego białka (peptydy) od N-końca.

C-terminalny AA można również za pomocą karboksypetydaz, czyli Oznaczanie C-terminalnego AA C-terminalny AA można również za pomocą karboksypetydaz, czyli enzymów hydrolizujących białka (peptydy) od C-końca.

Sekwencję AA oznacza się często za pomocą degradacji Edmana. Oznaczanie sekwencji AA w białku Sekwencję AA oznacza się często za pomocą degradacji Edmana. N-terminalny AA białka (peptydu) pod wpływem fenyloizotiocyjanianu zostaje odszczepiony i przekształcony w pochodne 3-fenylo-2-tiohydantoiny (PTH)

Za pomocą zwykłej degradacji Edmana można oznaczyć sekwencję do 10 kolejnych AA od N-końca; na skutek niepełnego odszczepienia N-terminalnego AA i równoczesnego odszczepienia drugiego z kolei AA wzrasta stężenie zanieczyszczeń, co utrudnia analizę. Dłuższe peptydy, a tym bardziej białka należy poddać niepełnej hydrolizie i przeprowadzić analizę sekwencyjną otrzymanych fragmentów peptydowych, po czym poskładać fragmentaryczne dane w całość podobnie jak układankę. Dużym ułatwieniem jest hydroliza białek (peptydów) za pomocą enzymów, które tną łańcuch peptydowy w określonych miejscach.

Enzymy specyficznie hydrolizujące wiązania peptydowe AA, którego wiązanie jest hydrolizowane Miejsce hydrolizy Trypsyna (T) Lys, Arg (AA zasadowe) AA-NHCH- Chymotrypsyna (CT) Tyr, Phe, Trp (aromatyczne) Pepsyna (P) -CO-NHAA Termolizyna (TL) Ile, Leu, Val (duże alifatyczne) Klostrypaina Arg Arg-NHCH- Proteaza ze Staphylococ. Asp Asp-NHCH-

Sekwencja AA b-MSH

Analizę sekwencyjną AA białek usprawniło zastosowanie automatycz-nych sekwentatorów, ich działanie jest też oparte na degradacji Edmana, ale reakcję prowadzi się na fazie stałej, w sposób podobny do syntezy peptydów metodą SPPS. Degradacja na fazie stałej pozwala na dokładnie wymycie wszystkich reagentów i produktów, dzięki czemu unika się gromadzenia zanieczyszczeń i reagentów, tak że kolejny etap degradacji daje wynik równie pewny jak poprzedni. Za pomocą automatycznego sekwentatora można określić sekwencję 100 kolejnych reszt AA. Enzymatyczna analiza sekwencyjna białek Zachowując ostrożność można za pomocą leucyloaminopeptydazy, kolejno odszczepiać AA od N-końca peptydu lub białka. Karbopeptyda-za A hydrolizuje większość AA C-terminalnych za wyjątkiem Lys, Arg, His i Pro, które z kolei są hydrolizowane przez karbopeptydazę B. Za pomocą mieszaniny tych enzymów można kolejno odszczepiać AA od C-końca; ich hydroliza biegnie jednak z różną szybkością, dlatego trudno opracować standardowe warunki.

Oznaczanie sekwencji AA za pomocą spektrometru mas Stosując odpowiednią jonizację peptydu można odszczepiać jego fragmenty w sposób umożliwiający ustalenie sekwencji AA. Wykorzystanie sekwencji genu odpowiedzialnego za biosyntezę białka do ustalenia sekwencji tego białka Sekwencja nukleotydów we fragmentach DNA (genach) jest łatwiejsza do ustalenia niż sekwencja AA w białkach. Sekwencja białka ustalona na podstawie budowy genu kodującego to białko odpowiada łańcuchowi makropeptydu utworzonego na rybosomach. W składzie AA białka rzeczywistego należy uwzględnić postrybosomalne modyfikacje.

Wiązanie peptydowe w białkach najczęściej występuje w formie trans. Struktura drugorzędowa białek – kształt i forma łańcucha białkowego O kształcie łańcucha peptydowego decyduje sekwencja AA i warunki zewnętrzne. Płaskie wiązanie peptydowe -CO-NH- jest częściowo usztywnione i zwykle przyjmuje ułożenie trans, rzadziej cis. Wokół innych wiązań zapewniony jest swobodny obrót. -N-Ca- -Ca-CO- Wiązanie peptydowe w białkach najczęściej występuje w formie trans. Reszta Pro preferuje formę cis i zwykle tam gdzie się ona znajduje dochodzi do zwrotu kierunku łańcucha peptydowego.

Łańcuch peptydowy, dzięki swobodnemu obrotu wokół większości wiązań charakteryzuje się dużą swobodą konformacyjną – może przyjmować różnorodne kształty. W rzeczywistości, zahamowanie obrotu wokół wiązania CO-NH-, właściwości reszt AA tworzących łańcuch peptydowy oraz wpływ środowiska ograniczają możliwości konformacyjne białek do pewnych form. Do najważniejszych, konformacyjnych form łańcuchów peptydowych należą struktury: helikalne (helisy), harmonijkowe (pofałdowanej kartki), zwroty (zgięcia), a,b czy g, kolagenowe i inne tzw. nieuporządkowane. Struktury helikalne - helisy Określone sekwencje AA wykazują tendencję do formowania łańcucha peptydowego w kształt śruby. Struktury takie nazywane są helisami; mogą mieć różne parametry i różne symbole, np. a-helisa; znane są inne helisy.

grupą -CO i grupą HN- czwartego z kolei aminokwasu Kształt śruby jest utrzymywany dzięki wiązaniom wodorowym -N-H.....O=C- pomiędzy grupami -NH i OC-, oddalonych od siebie wiązań peptydowych. W a-helisie wiązania wodorowe tworzą się pomiędzy grupą -CO i grupą HN- czwartego z kolei aminokwasu w łańcuchu peptydowym. h: skok zwoju d: część zwoju 1 AA n: liczba AA/zwój Helisa a jest przedstawiana również symbolem a(3,613), gdzie 3,6 oznacza liczbę AA tworzących jeden zwój. Liczba 13 mówi ile atomów znajduje się w pierścieniu połączonym wiązaniem wodorowym.

Do AA wykazujących tendencje do tworzenia układów helikalnych należą: Met, Glu, Leu, Ala, Gln, Lys, His i Cys. Aminokwasy destabilizujące strukturę helikalną to : Pro, Gly, Ile, Val, Leu, Tyr, Asn, Ser i Thr. Strukturę helikalną w białkach wykrywa się technikami chiralooptycznymi lub laserową spektroskopią Ramana. Struktura harmonijkowa b (pofałdowanej kartki) Tworzy się pomiędzy dwoma, równolegle ułożonymi fragmentami łańcucha peptydowego; znane są dwa typy tej struktury I i II. Struktury harmonijkowe równoległa antyrównoległa

Wiązanie peptydowe w sekwencji -AA-Pro- ma tendencję do przyjmowania formy geometrycznej cis. Zwrot b, (b-zgięcie, b-turn) Zwane również zgięciem spinki do włosów. Charakterystyczny element strukturalny, który zmienia kierunek łańcucha peptydowego o 180o. Bardzo często w b-zgięciu znajduje się Pro; jest to AA bez funkcji -NH-, wobec czego w tym miejscu układ helikalny zostaje przerwany. Najczęściej spotykanymi AA w b-zwrocie są Pro, Gly, Asp, Ser i Asn.

60% łańcuchów stastycznego białka przyjmuje konformację a-helisy lub b-harmonijki, kolejne miejsce zajmuje b-zwrot. Inną ważną struktura białka jest struktura kolagenowa. Kolagen należy do najpopularniejszych b. ssaków – główny składnik skóry, chrząstek, znacznej części mięśni, kości, ścięgien i zębów. Podstawową jednostką kolagenu jest superhelisa złożona z trzech polipeptydowych lewoskrętnych helis – różnych od a-helisy. Jednostka ta nosi nazwę tropokolagenu, a jej długość dochodzi do 300 nm.

Wyróżnia się również struktury naddrugorzędowe. Zalicza się do nich: pęczki 4 helis, układ bab (b-harmonijka-a-helisa-b-harmonijka), układ 8 fragmentów b otoczonych 8 a-helisami i inne. Struktura trzeciorzędowa wynika z działania sił przyciągających, np. jonowych, wodorowych czy typu van der Walsa.

Struktury trzeciorzędowe są odpowiedzialne za kształtowanie białek globularnych

laktoglobulina składa się z 2 podjednostek; katalaza wątroby wołu – 4; Struktura czwartorzędowa Opisuje agregaty złożone z dwóch lub więcej pojedynczych łańcuchów makropeptydowych, tzw. podjednostek. Podjednostki mogą być identyczne (b. homogeniczne) lub różne (b. heterogeniczne). białka homogeniczne laktoglobulina składa się z 2 podjednostek; katalaza wątroby wołu – 4; dehydrogenaza alkoholowa – 4, aminopeptydaza z cytozylu – 6, syntaza glutaminowa z mózgu świni – 8. białka heterogeniczne hemoglobina – 4, dehydrogenaza jabłczanowa – 4, kinaza asparaginowa – 4, wirus mozaiki tytoniowej – 2130.

W trakcie denaturacji zachodzą następujące procesy: rozpad agregatów; Denaturacja białek Właściwości biologiczne białek zależą od ich konformacji. Zmiana konformacji natywnej na inną powoduje zwykle całkowitą utratę aktywności biologicznej białka. Zmiana właściwości białka w wyniku przekształcenia jego konformacji nosi nazwę denaturacji białka. Denaturacja jest spowodowana przemianami w obrębie II, III i IV rzędowej struktury białka, nie dochodzi do rozrywania wiązań kowalencyjnych, tzn. zachowana zostaje struktura I rzędowa. Zmiany struktury I rzędowej związane są z degradacją białka, tj. z hydrolizą wiązań peptydowych. W trakcie denaturacji zachodzą następujące procesy: rozpad agregatów; niszczenie wiązań wodorowych i jonowych; deformacja układów helikalnych, struktur b i innych struktur. Denaturację powodują: podwyższona lub obniżona temperatura; rozpuszczalniki organiczne; detergenty; reduktory; promieniowanie twarde (X, UV, g); elektrolity lub substancje tworzące silne wiązania wodorowe (np. mocznik, guanidyna).

Denaturacja może być odwracalna lub nieodwracalna Denaturacja może być odwracalna lub nieodwracalna. Przykładem denaturacji nieodwracalnej jest gotowanie jajka; ugotowane jajko nie można przekształcić w jako surowe. Przykładem denaturacji odwracalnej jest rozpuszczanie i żelowanie żelatyny. Bardzo poglądowa jest denaturacja rybonukleazy, enzymu hydrolizującego kwasy rybonukleinowe. W łańcuchu rybonukleazy zawierającym 124 reszty AA znajdują się 4 mostki disulfitowe utworzone przez 8 reszt Cys. Mostki te są odpowiedzialne za utrzymanie aktywnej konformacji rybonukleazy.

o pierwotnych właściwościach. rybonukleaza zdenaturowana (nieaktywna) rybonukleaza natywna (aktywna) Utlenianie zdenaturowanej rybonukleazy tlenem z powietrza w warunkach zbliżonych do fizjologicznych (w wodzie, pH~7), bez reduktorów i czynników denaturujących odtwarza rybonukleazę o pierwotnych właściwościach. 1 2

Dla większości białek takie prawdopodobieństwo Utlenianie zdenaturowanej rybonukleazy w środowisku różnym od fizjologicznego, w obecności czynników denaturujących daje produkt wykazujący 1% aktywności. 1% - tyle mniej więcej wynosi prawdopodobieństwo przyjęcia natywnej konformacji. Dla większości białek takie prawdopodobieństwo jest znacznie mniejsze. Podczas tworzenia się białka pożądaną konformację wymuszają wówczas specjalne enzymy. Podobny problem był podczas łączenia dwóch łańcuchów insuliny. insulina

Denaturacja białek podczas obróbki termicznej produktów żywnościo-wych ma korzystne działanie. Następuje wówczas rozluźnienie i rozwinięcie łańcuchów polipeptydowych, co znacznie ułatwia trawienie. Nie bez znaczenia jest też dezaktywacja niektórych niepożądanych w pożywieniu enzymów, np. proteaz czy lipaz. Długotrwałe ogrzewanie potraw ma jednak działanie niekorzystne, powoduje rozkład niektórych AA, prowadzi do ich racemizacji oraz zwiększa usieciowanie łańcuchów polipetydowych.