Małgorzata Stachowiak Badania "product to product" - alternatywa dla testu konserwacji produktu kosmetycznego Małgorzata Stachowiak J.S. HAMILTON POLAND S.A.

Tytułem wstępu Człowiek jako źródło zanieczyszczenia mikrobiologicznego Całkowita masa bakterii wynosi ok. 2 kg 99% DNA , które mamy w sobie , to w rzeczywistości DNA bakterii zamieszkujących nasze jelita

( TESTU OBCIĄŻENIOWEGO , CHALLENGE TEST ) Definicja Dobór i ocenę skuteczności działania konserwantów przeprowadzić można za pomocą TESTU KONSERWACJI ( TESTU OBCIĄŻENIOWEGO , CHALLENGE TEST )

Cel testu konserwacji: ocena działania konserwantów wobec szczepów środowiskowych; dobór i sprawdzenie skuteczności układu konserwującego użytego w produkcie na etapie końcowym; potwierdzenie stabilności użytego układu konserwującego

PN-EN ISO 11930:2012 Kosmetyki -- Mikrobiologia -- Test skuteczności i ocena zakonserwowania produktów kosmetycznych Metoda przeznaczona przede wszystkim dla produktów kosmetycznych rozpuszczalnych w wodzie lub mieszających się z wodą i może wymagać dostosowania na przykład do badania produktów, w których woda jest fazą wewnętrzną

product to product inoculation Ocena zakonserwowania produktów kosmetycznych polegająca na zaszczepianiu badanej próbki porcją zanieczyszczonego produktu kosmetycznego. cel . Utrzymanie wirulencji szczepów oportunistycznych Odzwierciedlenie zanieczyszczenia kosmetyku w trakcie produkcji Utrzymanie agresywności zanieczyszczonego produktu

Cechy zarazka Inwazyjność - umiejętność przenikania do organizmu i szerzenia się w nim Zjadliwość - zdolność przełamania sił obronnych i wywołania objawów

Białka błony zewnętrznej ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych

szczepy oportunistyczne Burkholderia cepacia , Pseudomonas aeruginosa zakażające chorych lub osoby osłabione – związane z zakażeniami przyrannymi, zakażeniami układu moczowego, posocznicą ,wtórnymi zapaleniami płuc, a także zakażeniami szpitalnymi. Hiszpania -2006 rok , oddział OIOM Rezerwuar B.cepacia- mleczko nawilżajace

PN-EN ISO 29621:2011 Test skuteczności konserwacji przeprowadzany zgodnie z normą ISO 11930 i metodyka product to product nie jest wymagany w przypadku tych produktów kosmetycznych, w przypadku których ryzyko mikrobiologicznego zanieczyszczenia zostało ustalone na niskim poziomie , zgodnie z normą PN-EN ISO 29621:2011(Kosmetyki – Mikrobiologia – Przewodnik do oceny ryzyka i identyfikacji produktów niskiego ryzyka mikrobiologicznego)

PN-EN ISO 29621:2011 Podatność na zakażenie wysoka średnia mała Produkty stosowane wokół oczu Emulsje Kremy do ust Produkty na bazie wody Surowce pochodzenia naturalnego Sprasowane pudry Preparaty w sztyfcie Sypkie pudry Pudry do kapania (talki) Grupa produktów w formie aerozoli Pudry do oczu i sztyfty Preparaty alkoholowe (>=20%) Dezodoranty i antyperspiranty Sole do kapania Aerozole Surowce z właściwościami przeciwdrobnoustrojowymi

PN-EN ISO 29621:2011 Brak podatności na zakażenie Produkty, w których drobnoustroje nie rozwijają się, określone na podstawie: Wyników wykonywanych testów obciążeniowych Danych historycznych i charakterystyki mikrobiologicznej wynikającej z zawartości i produkcji produktów na przestrzeni lat

PN-EN ISO 29621:2011 Ocena ryzyka aw pH alkohol surowce pakowanie Produkcja,

PN-EN ISO 29621:2011 Czynnik fizyko – chemiczny Limit Przykład pH < 3 > 10 Produkty do oczyszczania skory na bazie glicolic acid Produkty do włosów Produkty utleniające Utleniające do włosów Alkohol etylowy > 20% Produkty do włosów (rozpylacze, toniki, perfumy) Temp. napełniania > 650 C Produkty do ust, pomadki, błyszczyki w kremie aw <0.75 Produkty na bazie rozpuszczalników Lakiery do paznokci Aluminium chlorohydrate > 25% antyperspiranty

product to product inoculation Test konserwacji polega na : kontrolowanym, jednorazowym kontaminowaniu próbek zakonserwowanego produktu określonymi szczepami testowymi umieszczonymi w zanieczyszczonym produkcie Jest to symulacja wtórnego zakażenia jakie może powstać podczas użytkowania produktu przez konsumenta

product to product inoculation Parametry testu konserwacji : dobór szczepów testowych - środowiskowych; gęstość inokulum zakażającego; liczba wysiewów; czas kontaktu szczepów z produktem; stopień przeżycia drobnoustrojów

podłoża Podłoża rozcieńczalniki TSA- agar tryptozowo-sojowy- bakterie SDA-Sabouraud dextrose agar- pleśnie i drożdże Eugon LT 100 liquid broth,rozcieńczalnik z peptonem, rozcieńczalnik z Tween 80 Podłoża rozcieńczalniki

inokulum zakażajace Oznaczyć liczbę bakterii na podłożu TSA Dodać 1-1,05g /ml inokulum zakażającego do 9 ml bulionu Eugon LT 100, wymieszać Wykonać serię rozcieńczeń w MRD do 10-7 Oznaczyć liczbę bakterii na podłożu TSA i pleśni/drożdży na SDA wysiewając 1 ml z rozcieńczenia od 10-4 do 10-7 25,0 ± 1,0 0C –5 dni - pleśnie Inkubować 30,0 ± 1,0 0C –72 h – bakterie , drożdże ,

inokulum zakażajace Ważne 1. Zanieczyszczony produkt przechowywać w temperaturze pokojowej 2. Ocenę najwyższego odzysku przeprowadzić na co najmniej pięciu próbkach , dwie z najwyższym odzyskiem użyć do testu konserwacji Poziom odzysku drobnoustrojów po inokulacji w badanej próbce –min. 1,0 x 104 jtk/g lub ml

badanie Odważyć aseptycznie 30±0.5g badanej próbki do pojemnika z polipropylenu Dodać więcej niż 0,5 g zanieczyszczonego produktu lub mieszanki do próbki testowej, wymieszać Oznaczyć liczbę drobnoustrojów po 5 minutach od zaszczepienia- dzień 0, ponownie po 48h (tylko bakterie), 7,14 i 28 dniach wykonując posiewy rozcieńczeń próbki 10-1 do 10-4 przechowywać próbki w 22,5 °C między kolejnymi przesiewami

interpretacja wyników Kryteria oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej Logarytm redukcji liczby zdolnych do życia drobnoustrojów (R): Rx = log N0 – log Nx log No – logarytm liczby mikroorganizmów w 1 g próbki bezpośrednio po zakażeniu; log Nx – logarytm liczby mikroorganizmów w 1 g próbki po określonym czasie posiewu.

interpretacja wyników Redukcja inokulum zakażającego o 2 log10 w ciągu 48 h i liczba nie zwiększa się po 7 , 14 i 28 dniach po zaszczepieniu Kryteria - odpowiednik Farmakopei Europejskiej - redukcja inokulum zakażającego o 2 log10 w ciągu 48 h i o 3 log10 po 7 dniach, po 14 i 28 liczba nie zwiększa się

The product to product inoculum wyniki   Log reduction T 0 T 2 criteria T 7 T 14 T28 The product to product inoculum 5,72 2,79 ≥ 2 4,72 NI T0- log drobnoustrojów po 5 minutach od zakażenia Rx =lg N0- lgNx No- liczba drobnoustrojów w czasie t0 Nx- liczba drobnoustrojów w czasie tx NI- liczba drobnoustrojów nie zwiększa się w czasie T7,T14,T28 dni

Dziękuję za uwagę