Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników E N D O G E N N E E G Z O G E N N E chemioterapia proc. zapalne oksydaza NADPH promien. jonizujące UV peroksysomy toksyny mitochondria H2O2 OH● ONOO– O2●– NO● Reaktywne formy tlenu Inhibicja proliferacji Osłabiona odpowiedź immunologiczna Homeostaza Generacja uszkodzeń Aktywacja szlaków sygnałowych

Reaktywne Formy Tlenu ROLA FIZJOLOGICZNA USZKODZENIA I CHOROBY aktywacja ERK1/2 aktywacja AP-1 translokacja NFκB aktywacja PKC-α peroksydacja lipidów utlenianie cukrów i tioli oksydacja DNA uszkodzenia kwasów nukleinowych odpowiedź zapalna relaksacja mięśni gładkich mitogeneza apoptoza starzenie karcenogeneza miażdżyca choroby neurodegeneracyjne

Obrona antyoksydacyjna NIEENZYMATYCZNA flawonoidy albumina metalotioneiny witaminy ACE melatoniny glutation ENZYMATYCZNA katalaza (CAT) dysmutazy ponadtlenkowe (SOD) peroksydaza glutationu (GPX)

dysmutaza ponadtlenkowa lokalizacja komórkowa 0.1% - 2% pobieranego tlenu ulega konwersji do anionorodnika ponadtlenkowego (O2●–) SOD CAT O2●– H2O2 H2O + O2 GPX dysmutaza ponadtlenkowa lokalizacja komórkowa CuZnSOD (SOD1) Cytoplazma MnSOD (SOD2) Mitochondria, błona wewn. ECSOD (SOD3) błona komórkowa, zewn.

Manganozależna Dysmutaza Ponadtlenkowa (MnSOD, SOD2) homotetramer – 88 kDa zawiera jony Mn w miejscu aktywnym zlokalizowana w błonie wewnętrznej mitochondrium kodowana przez gen jądrowy gen MnSOD jest złożony z 5 eksonów i 4 intronów E1 E2 E3 E4 E5

wszystkie zwierzęta pozbawione genu MnSOD umierają przed 2 tyg. życia MnSOD jest niezbędny zwierzęta KNOCK-OUT Li et al., 1995: spowolniony wzrost niewydolność fizyczna kardiomiopatia rozstrzeniowa powiększona wątroba depozyty bałkowe w mięśniach szkieletu Lebovitz et al., 1996: zaburzenia motoryczne zmiany degeneracyjne w o.u.n. uszkodzone i napęczniałe mitochondria wszystkie zwierzęta pozbawione genu MnSOD umierają przed 2 tyg. życia

Konstrukt DNA użyty do wygenerowania nadekspresji MnSOD intron Myc tag MnSOD cDNA IRES EGFP GPX pTRE2hyg/SOD2ex plazmid ekspresyjny

Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy Tet-OFF plazmid regulacyjny P CMV tetR VP16 tTA –Dox (Tet) +Dox (Tet) tTA tTA MnSOD EGFP MnSOD EGFP TRE P CMV TRE P CMV plazmid ekspresyjny X X

Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy Tet-ON plazmid regulacyjny P CMV tetR VP16 tTA +Dox (Tet) –Dox (Tet) tTA tTA MnSOD EGFP MnSOD EGFP TRE P CMV TRE P CMV plazmid ekspresyjny X X

Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy Tet-OFF + plazmid ekspresyjny Tet-ON + plazmid ekspresyjny ─ Dox ─ Dox + Dox + Dox

Regulowana nadekspresja MnSOD – system Tet-OFF expression ON expression OFF nadekspresja ekspresja fizjologiczna

Regulowana nadekspresja MnSOD – potwierdzenie działania funkcjonalnego Western blotting z użyciem przeciwciała Anti-MnSOD 1 – komórki nietransfekowane 2 – transfekowane - Dox 3 – transfekowane + Dox Żel aktywności MnSOD 1 – nadekspresja 2 – kontrolna transfekc. 3 – bez transfekc.

ĆWICZENIE pSuper-SOD2-RNAi

Transfekcje komórek DNA użyty do transfekcji: Tet-OFF + SODex + pSuper Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi

ANALIZA FACS Tet-OFF + SODex + pSuper 1 Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi 2

ANALIZA FACS Tet-OFF + SODex + pSuper 3 Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi 4

Wprowadzić dyskusję nt Wprowadzić dyskusję nt. jak wykonać eksperyment naukowy do sprawdzenia wyciszania, aktywności Tg na poziomach mRNA i białkowym. Jak zaplanować eksperyment – jakie są potrzebne kontrole ?