POLITECHNIKA ŚLĄSKA WYDZIAŁ CHEMICZNY

Prezentacja na temat: "POLITECHNIKA ŚLĄSKA WYDZIAŁ CHEMICZNY"— Zapis prezentacji:

1 POLITECHNIKA ŚLĄSKA WYDZIAŁ CHEMICZNY KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII Wpływ hipoksji na ekspresję genu HSPA2 w keratynocytach NHEK i HaCaT oraz komórkach raka płaskonabłonkowego Anna HABRYKA Promotor: prof. Zdzisław KRAWCZYK Promotor pomocniczy: dr Dorota ŚCIEGLIŃSKA

2 HSPA2 Gen należący do rodziny HSPA.
Ulega ekspresji w komórkach nowotworowych (m.in. A549, NCIH1299, MCF7, HeLa) oraz guzach pierwotnych płuc, szyjki macicy i pęcherza moczowego (Rohde i wsp., 2005; Ścieglińska i wsp., 2008; Garg i wsp.2010; Ścieglińska i wsp., 2014). Ulega ekspresji w licznych narządach i tkankach somatycznych człowieka, przy czym ekspresja ograniczona jest do specyficznych populacji komórek (Ścieglińska i wsp., 2011). Ścieglińska i wsp., 2011

3 Hipoksja Obniżenie stężenia tlenu poniżej wartości fizjologicznej.
Występuje często w guzach litych i jest związana z nieprawidłowościami w budowie naczyń krwionośnych i/lub ich niedostateczną gęstością (Vaupe i Harrison, 2004; Wouters i wsp., 2007; Rofstad i wsp., 2007; Brahimi-Horn i wsp., 2007). W guzach litych wiąże się ze zmniejszoną wrażliwością komórek na działanie czynników terapeutycznych takich jak radioterapia czy chemioterapia (Brahimi-Horn i wsp., 2007; Wilson i Hay, 2011). B16(F10) De Vita JR i wsp., 2001 Olbryt i wsp., 2006

4 Czynnik transkrypcyjny HIF-1
Heterodimer zbudowany z podjednostek: α (zależnej od stężenia tlenu w komórce) oraz β (ulegającej konstytutywnej ekspresji). Regulacja stabilności podjednostki HIF-1 α zachodzi na drodze regulacji przez hydroksylazy proliny (PHD) oraz hydroksylazę asparaginy (FIH). Wiąże się do sekwencji (A/G)CGTG zwanej Hypoxia Responsive Element (HRE).

5 Hipoksja i HIF-1 w skórze
Rola HIF-1 w skórze FIZJOLOGICZNA Prawidłowe różnicowanie keratynocytów (Weir i wsp., 2009) Ochrona przed infekcjami (Werth i wsp., 2010) Gojenie się ran (Fitsialos i wsp., 2008; Rezvani i wsp., 2011) PATOLOGICZNA Defekty w różnicowaniu naskórka (Takagi i wsp., 2003, Geng i wsp., 2006) Łuszczyca (Rosenberger i wsp., 2007) Chroniczne rany (Mace i wsp., 2007; Botusan i wsp., 2008) Transformacja melanocytów (Bedogni i wsp., 2005) Powstawanie niemelanocytarnych nowotworów skóry (Lining i wsp., 2009; An i wsp., 2014) za Nys i wsp., 2011, zmodyfikowane HIF1 Revzani i wsp., 2011

6 Główny model badawczy :
Ekspresja HSPA2 i HIF1 w keratynocytach warstwy bazalnej naskórka Analiza in silico promotora HSPA2 HIF1 Revzani i wsp., 2011 Główny model badawczy : immortalizowane keratynocyty HaCaT

7 Główny cel pracy doktorskiej
Wyjaśnienie czy w keratynocytach aktywność genu HSPA2 może być modulowana poprzez oddziaływanie czynnika transkrypcyjnego HIF-1 z sekwencją HRE.

8 Hipoksja – 1% O2 Stabilizacja białka HIF-1α
Poziom transkryptów genów markerowych: CAIX, GLUT1, NDRG1 Poziom transkryptów HSPA2 Poziom białka HSPA2 Oddziaływanie HIF-1 z HRE –> ChIP-qPCR Analiza funkcjonalna promotora -> Dual Lucyferase Reporter Assay System (Promega)

9 Hipoksja powoduje obniżenie ekspresji HSPA2 w keratynocytach HaCaT
qRT-PCR Względny poziom mRNA HSPA2 Taki sam wynik uzyskano dla pierwotnych keratynocytów NHEK oraz komórek raka płaskonabłonkowego A431.

10 HIF-1α wiąże się do sekwencji HRE w promotorze genu HSPA2
Lokalizacja starterów ChIP-qPCR k – kontrola h3 – hipoksja 3h h3e – hipoksja 3h + echinomycyna 160 nM h6 – hipoksja 6h h6e – hipoksja 6h + echinomycyna 160 nM

11 Aktywność promotora HSPA2 spada w warunkach hipoksji
Plazmid zawierający fragment sekwencji promotora genu VEGF połączony z genem kodującym lucyferazę. Względny poziom aktywności Plazmid pHRE-luc został podarowany przez prof. Józefa Dulaka z UJ oraz dr H. Kimure z Southwestern Medical Center w Dallas (USA)

12 Stabilizacja HIF-1α w warunkach standardowych
Deferoksamina (DFO) Chlorek kobaltu (CoCl2) Nadekspresja stabilnej formy białka HIF-1α

13 Deferoksamina i chlorek kobaltu powodują stabilizację HIF-1α
w warunkach standardowych Względny poziom aktywności NDRG1 NDRG1

14 Hipoksja ≠ Hipoksja chemiczna
Deferoksamina Chlorek kobaltu Względny poziom aktywności Wzrost aktywacji promotora HSPA2 niezależny od HRE Chlorek kobaltu powoduje powstawanie wolnych rodników Hipoksja ≠ Hipoksja chemiczna

15 Nadekspresja stabilnej formy białka HIF-1α w warunkach standardowych
prowadzi do obniżenia poziomu transkryptów HSPA2 Wektory do nadekspresji podarowane przez prof. Lorenza Poellingera z Instytutu Karolińska w Sztokholmie. Wektor kontrolny (kodujący białko zielonej fluorescencji) podarowany przez dr Agnieszkę Łobodę i prof. Józefa Dulaka z Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie.

16 Inhibicja HIF-1 w warunkach hipoksji
N-acetylocysteina (NAC) – destabilizacja białka HIF-1 Echinomycyna – hamowanie oddziaływania HIF-1 z DNA Wyciszenie HIF-1α metodą RNAi

17 Obniżenie poziomu HIF-1α przez N-acetylocysteinę (NAC) zwiększa aktywność promotora HSPA2

18 Zahamowanie oddziaływań HIF-1 z DNA przez echinomycynę
powoduje wzrost ekspresji HSPA2 Analiza funkcjonalna promotora genu HSPA2 Chipa na poczatek Western blot PCR K – kontrola H – Hipoksja He1 – Hipoksja + Echinomycyna 80 nM He2 – Hipoksja + Echinomycyna 160 nM

19 Wyciszenie HIF-1α w warunkach hipoksji prowadzi do wzrostu ekspresji HSPA2
Względny poziom mRNA HIF-1α Względny poziom mRNA HSPA2 Scr H / shC H / shD H Scr / Scr H / shC H / shD H Zmienic wykresy na słupki Scr – wstawka kontrolna Scrambled shC – wstawka C wyciszająca HIF-1α shD – wstawka D wyciszająca HIF-1α H – hipoksja 24h

20 HepG2 MCF-7 HeLa Pierwsza strona, linie i ze rośnie

21 HIF-1 aktywuje ekspresję HSPA2 w komórkach HeLa
Analiza funkcjonalna promotora genu HSPA2 Nadekspresja HIF-1α Hipoksja - 24 godziny

22 Reoksygenacja 1% O2 hipoksja 24h 21% O2 warunki standardowe 4h lub 8h
Stres oksydacyjny

23 Ekspresja HSPA2 wzrasta w warunkach reoksygenacji
Funkcjonalna analiza promotora Poziom mRNA

24 WNIOSKI: W keratynocytach HIF-1 działa jako negatywny regulator ekspresji genu HSPA2. Udział czynnika transkrypcyjnego HIF-1 w regulacji ekspresji genu HSPA2 może by zróżnicowany i zależeć od typu komórek. Ekspresja genu HSPA2 może by pobudzana w warunkach stresu oksydacyjnego.

25 Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów
Badania finansowane z grantów: Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego N oraz Narodowego Centrum Nauki N/NZ1/05/2012/00022 Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów dr Dorota Ścieglińska dr Agnieszka Gogler-Pigłowska prof. Zdzisław Krawczyk mgr Damian Sojka mgr Katarzyna Klarzyńska Krystyna Klyszcz Klinika Chirurgii Onkologicznej dr Mariusz Kryj

26 Dziękuję za uwagę