BIOAUTOGRAFIA TLC – ZASTOSOWANIE W OCENIE WŁAŚCIWOŚCI ANTYBAKTERYJNYCH EKSTRAKTÓW ROŚLINNYCH Skorek M1, Jesionek W2, Majer-Dziedzic B3, Sajewicz M1, Kowalska T1, Choma I2 1Zakład Chemii Ogólnej i Chromatografii, Instytut Chemii, Uniwersytet Śląski w Katowicach 2Zakład Metod Chromatograficznych, Wydział Chemii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 3Zakład Mikrobiologii Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie Wprowadzenie Ekstrakty roślinne zawierają polifenole, stanowiące system odpornościowy roślin. Ekstrakty te są powszechnie stosowane w farmakologii i kosmetyce, gdyż wykazują właściwości antyoksydacyjne, przeciwzapalne, przeciwnowotworowe, detoksykujące, antybakteryjne, przeciwgrzybiczne itp. Z tego też względu ekstrakty roślinne są stosowane w profilaktyce oraz leczeniu wielu schorzeń (np. chorób serca, czy żylaków). Bogatym źródłem polifenoli są ciemne owoce, np. borówki, winogrona, granaty, czarny bez oraz takie napoje, jak zielona herbata, czerwone wino, kawa itp. Obecnie oprócz badania właściwości chemicznych i fizycznych substancji powszechnie wykonuje się też analizy biologiczne, np. techniką bioautografii. Bioautografia służy przede wszystkim do określania właściwości antybakteryjnych i przeciwgrzybicznych analizowanych substancji, a także do śledzenia procesów biochemicznych i określania czynników wpływających na wzrost bakterii. Znane są trzy wersja bioautografii, tj. poprzez kontakt, zanurzenie i w sposób bezpośredni [1,2]. Bioautografia Obecnie popularną metodą badania właściwości antybakteryjnych jest bioautografia bezpośrednia. W przypadku tej metody płytkę pokrytą żelem krzemionkowym z nakroplonymi próbkami (w ilości 10 µl) zanurza się w zawiesinie odpowiednio dobranych mikroorganizmów Bacillus subtilis, a następnie inkubuje w wilgotnym powietrzu (17h w 37°C). W rezultacie płytka chromatograficzna zostaje nasączona składnikami odżywczymi, co umożliwia wzrost mikroorganizmów bezpośrednio na jej powierzchni. W miejscach, gdzie znajdują się substancje o właściwościach przeciwbakteryjnych, tworzą się widoczne strefy zahamowania wzrostu drobnoustrojów. Następnie płytkę spryskuje się kontrastem w celu dokonania wizualizacji stref zahamowania wzrostu[2-4]. Uwidocznienie stref odbywa się dzięki zastosowaniu formazanu błękitu triazolowego (MTT). W wyniku działania mitochondrialnego enzymu dehydrogenazy obecnego w żywych komórkach bakteryjnych, sól tetrazolowa przekształcana jest do purpurowego formazanu. W rezultacie na bioautogramach pojawiają się nieodbarwione plamki na purpurowym tle. Metodą bioautografii zostały przebadane właściwości antybakteryjne ekstraktów roślinnych, stosowanych do produkcji kosmetyków, tj. właściwości ekstraktów czerwonego wina, nasion i skórek winogron, ekstraktu z soku i skórek granatu, ekstraktu soku żurawinowego, soków z owoców malin oraz soku i naparu z borówki czarnej. Wyniki eksperymentu zostały przedstawione w postaci bioautogramów. Wyniki Tabela uwidacznia aktywność antybakteryjną poszczególnych produktów. Płytki po wysuszeniu fotografowano w skali 1:1 z zachowaniem rzeczywistej barwy, przy użyciu urządzenia TLC Visualizer (Camag). Powierzchnię plamek na wydrukach bioautogramów zmierzono przy użyciu planimetru. Średnie powierzchnie [cm2] strefy zahamowanie wzrostu drobnoustrojów przedstawia tabela. Bioautogram – zdjęcia Rodzaj próbki Powierzchnia strefy zahamowanie wzrostu bakterii [cm2] Ekstrakt ze skórek czerwonych winogron 1% (roztwór metanolowy) Producent/Dystrybutor: Natur Vit Chem 1,48 (roztwór wodny) 1,33 Ekstrakt z nasion winogron 1% (roztwór etanolowy 96%) Producent/Dystrybutor: Zrób sobie krem Kosmetyki Naturalne 0,68 0,67 Ekstrakt z czerwonego wina 1% (roztwór etanolowo-wodny 33%) 0,65 Ekstrakt soku z żurawiny 1% Bioautogram – zdjęcia Rodzaj próbki Powierzchnia strefy zahamowanie wzrostu bakterii [cm2] Napar z borówki czarnej (8 g suszu w 200 ml wody) Producent/Dystrybutor: Karwon Gostyń 0,62 Sok domowy z borówki czarnej (25 % roztwór wodny) Producent/Dystrybutor: sok domowy, słodzony pasteryzowany 0,48 Ekstrakt z soku borówki czarnej 1% (roztwór wodny) Producent/Dystrybutor: Zrób sobie krem Kosmetyki Naturalne 0,37 Ekstrakt z soku granatu 1% 0,75 Ekstrakt ze skórki granatu 1% 0,73 Sok malinowy MalinaVital Producent/Dystrybutor: Olefarm – sok 100%, bez cukru, pasteryzowany 8,15 Sok domowy malinowy 0,33 Wnioski Wśród wszystkich próbek, największą aktywnością antybakteryjną wyróżnia się sok malinowy (bez cukru, pasteryzowany). Aktywności nie wykazywały ekstrakt soku żurawinowego oraz roztwór etanolowy ekstraktu z czerwonego wina. Wśród ekstraktów z winorośli największą strefę zahamowania wzrostu bakterii wykazują ekstrakty ze skórek czerwonych winogron, najmniejszą ekstrakty z czerwonego wina. Spośród substratów do zastosowań kosmetycznych działanie antyoksydacyjne wykazywały również ekstrakt z soku i skórki granatu (porównywalne pola zahamowania wzrostu). Ekstrakty o silnym działaniu antybakteryjnym zastosowane w kosmetykach mogą obniżać dodatek sztucznych konserwantów lub wykluczyć ich dodawanie do tego typu wyrobów. Bibliografia: [1] Choma I.M., Grzelak E. M. J. Chromatogr. A 2011, 1218, 2684-2691. [2] Grzelak E.M., Jesionek W., Majer-Dziedzic B. et al.: JAOAC 2013, 96, 1167-1174. [3] Tyihak E., Moricz A.M., Ott P.G. Med. Chem. 2012, 8, 75-84. [4] Tyihák E., Botz L., Nagy S. et al.: In “Proc. Intern. Symp. on Planar Separations, Planar Chromatography“ (Nyiredy Sz. Ed.), Budakalász 2001, 3.