Analiza ekstraktów roślinnych różnych gatunków szałwii (Salvia L Analiza ekstraktów roślinnych różnych gatunków szałwii (Salvia L.) techniką chromatografii cienkowarstwowej TLC/densytometria M. Sajewicz1, D. Staszek1, Ł. Wojtal1, Ł. Cieśla2, M. Waksmundzka-Hajnos2, and T. Kowalska1 1Instytut Chemii, Zakład Chemii Ogólnej i Chromatografii, Uniwersytet Śląski , ul. Szkolna 9, 40-006 Katowice 2 Katedra Chemii, Zakład Chemii Nieorganicznej, Uniwersytet Medyczny, ul. Staszica 6, 20-081 Lublin Celem naszych badań było porównanie zawartości kwasów fenolowych i flawonoidów w dwudziestu gatunkach szałwii (Salvia L.): S. amplexicaulis, S. atropatana, S. azurea, S. cadmica, S. canariensis, S. deserta, S.forskaohlei, S. glutinosa, S. hians, S. jurisicii, S. lavandulifolia, S. nemorosa, S. officinalis, S. pratensis ssp.Hematodes, S. sclarea, S. staminea, S. stepposa, S. tesquicola, S. triloba i S. verticillata. Ekstrakcja Do eksperymentu użyto ekstraktów z suszonych liści dwudziestu gatunków szałwii, zebranych w latach 2007 i 2008. Wykonano również ekstrakty ze świeżych liści szałwiii zebranych w 2008 roku. Materiał roślinny pochodził z Ogrodu Roślin Leczniczych Katedry Farmakognozji Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Rośliny suszono w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze 35-40°C przez 40h. Otrzymany susz, jak również świeże zioła, do czasu analizy przechowywano w stanie zamrożenia. Ekstrakcję przeprowadzono w aparacie ASE 200 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Dokładną procedurę wykonania ekstraktów przedstawiono w poniższej tabeli. Ekstrakty heksanowe odrzucono, ekstrakcja ta miała na celu jedynie eliminacje chlorofilu i mniej polarnych substancji. Otrzymane metanolowe ekstrakty odparowywano do sucha, a następnie rozpuszczano suchą pozostałość w 5mL metanolu. Całość umieszczano na 15 min w łaźni ultradźwiękowej (model RK 255H Sonorex Super; Bandelin, Berlin, Niemcy), po czym próbki zatężano do objętości 1mL. Następnie każdy ekstrakt filtrowano przez filtr strzykawkowy Anotop – średnica 25 mm, średnia średnica ziarna: 0,02 μm, membrana: tlenek glinu (cat. #11320, Merck). Tak przygotowane ekstrakty poddano analizie chromatograficznej. Chromatografia cienkowarstwowa z detekcją densytometryczną (TLC/densytometria) Analiza fingerprintów różnych gatunków szałwii techniką jednokierunkowej chromatografii cienkowarstwowej Jako fazy stacjonarnej użyto żelu krzemionkowego (płytki szklane pokryte 0,25mm warstwą żelu krzemionkowego Si 60 F254 o wymiarach 10 cm x 20 cm, Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy; cat. #1.05729). Jako fazy ruchomej użyto mieszaniny rozpuszczalników toluen + 1,4-dioksan w stosunku objętościowym 7:2 (v/v). Na płytki nakraplano po 5μL metanolowych ekstraktów szałwii, wykonanych z suszonych roślin. Chromatogramy rozwijano w komorach poziomych DS (Chromdes, Lublin), następnie skanowano przy użyciu densytometru skaningowego CD 60 Desaga (Heidelberg, Niemcy). Kolejnym krokiem było wywołanie płytek 5% metanolowym roztworem 2-aminoetylodifenylo boranu i utrwalenie 5% metanolowym roztworem PEG 4000. Zdjęcia chromatogramów wykonano pod lampą UV (Camag, Muttenz, Szwajcaria) przy długości fali λ = 366nm. Rozpuszczalnik Temperatura [°C] Ciśnienie [atm] Czas wstępnego ogrzewania próbki [min] Czas ogrzewania próbki po dodaniu rozpuszczalnika Czas ekstrakcji statycznej Objętość użytego rozpuszczalnika [mL] Ilość cykli n-Heksan 40 68 10 5 2 Metanol 100 65 Salvia amplexicaulis 254 nm susz Salvia amplexicaulis 366 nm susz Salvia amplexicaulis 254 nm świeża Salvia amplexicaulis 366 nm świeża a) b) c) d) Rys. 4. Porównanie profili stężeniowych świeżej i suszonej szałwii przy dwóch długościach fali λ= 254nm i 366nm Fazę stacjonarną układu chromatograficznego stanowił żel krzemionkowy (płytki szklane HPTLC pokryte ?mm warstwą żelu krzemionkowego o wymiarach 10 cm x 10 cm, Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy; cat. #???). Na płytki nakraplano po ??? μL każdego z metanolowych ekstraktów. Chromatogramy rozwijano w komorach poziomych DS (Chromdes, Lublin). Fazy ruchome użyte do eksperymentu podano w poniższej tabeli. e) f) g) h) 1 2 3 4 5 Toluen + AcOEt + HCOOH (70 + 30 +1) - 366 nm Toluen + AcOEt (5 + 95), wywoływacz: kwas siarkowy, (15 + 85) wywoływacz: kwas siarkowy VIS sulphuric acid agent 254 nm 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 i) j) k) l) Rys. 1. Sezonowe porównanie chromatogramów i densytogramów wybranych gatunków szałwii (Salvia L.) : Salvia glutinosa a) 2007 b) 2008 Salvia lavandulifolia c) 2007 d) 2008 Salvia nemorosa e) 2007 f) 2008 Salvia stepposa g) 2007 h) 2008 Salvia triloba i) 2007 j) 2008 Salvia verticilla k) 2007 l) 2008 Salvia azurea Salvia officinalis 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Jako fazy stacjonarnej użyto żelu krzemionkowego (płytki szklane HPTLC pokryte ?mm warstwą żelu krzemionkowego o wymiarach 10 cm x 20 cm, Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy; cat. #???). Jako fazy ruchomej dla frakcji mniej polarnej użyto mieszaniny rozpuszczalników toluen + octan etylu + kwas mrówkowy w stosunku objętościowym 70 + 30 + 1 (v/v) Na płytki nakraplano po ??? μL każdego z ekstraktów metanolowych. Chromatogramy rozwijano w komorach poziomych DS (Chromdes, Lublin), następnie skanowano przy użyciu densytometru skaningowego ??Camag (???). Kolejnym krokiem było wywołanie płytek 10% metanolowym roztworem kwasu siarkowego (VI). Zdjęcia chromatogramów wykonano w świetle widzialnym i pod lampą UV (Camag, Muttenz, Szwajcaria), przy długości fali λ=366 nm. Nr Gatunek 1 S. lavandulifolia 2 S. sclarea 3 S. tesquicola 4 S. staminea 5 S. amplexicaulis 6 S. cadmica 7 S. pratensis 8 S. canariensis 9 S. nemorosa 10 S. jurisicii 11 S. stepposa 12 S. hians 13 S. officinalis 14 S. forskohlei 15 S. azurea 16 S. verticillata 17 S. triloba 18 S. deserta 19 S. glutinosa 20 S. atropatana Salvia jurisicii Salvia tesquicola 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Rys.2. Profile stężeniowe metanolowych ekstraktów szałwii (Salvia L.), wykonanych z suszonego materiału roślinnego (w świetle widzialnym) Wnioski Z rysunku 4 wynika, że ekstrakty z suszonego materiału roślinnego zawierają więcej analizowanych substancji, niż ekstrakty sporządzone ze świeżych, nie suszonych roślin. Sezonowe porównanie profili stężeniowych różnych gatunków szałwii wykazało znaczne podobieństwo pod względem jakościowym w obrębie jednego gatunku. Ze względu na różnorodną polarność związków zawartych w ekstraktach szałwii nie jest możliwe jednoznaczne wytypowanie tylko jednego układu chromatograficznego, który będzie odpowiedni dla rozdziału wszystkich tych substancji. Zastosowane układy chromatograficzne wykazują znaczne różnice w składzie chemicznym w obrębie badanych gatunków. References [1] E. Reich, A. Schibli, High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medicinal Plants. Thieme, New York, 2008. [2] X.H. Fan, Y.Y. Cheng, Z.L. Ye, R.C. Lin, Z.Z., Qian, Anal. Chim. Acta, 555 (2006) 217. [3] Ł. Cieśla, A. Bogucka-Kocka, M. Hajnos, A. Petruczynik, M. Waksmundzka-Hajnos, J. Chromatogr. A, 1207 (2008) 160. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 *Praca jednego z autorów (Łukasz Wojtal) jest od 2008 roku częściowo wspomagana przez stypendium projektu „Uniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzy”, współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Rys.3. Profile stężeniowe metanolowych ekstraktów szałwii (Salvia L.), wykonanych z suszonego materiału roślinnego (pod lampą UV, przy długości fali  = 366 nm)