Porównanie różnych metod wyodrębniania lotnych substancji organicznych zawartych w wybranych gatunkach szałwii (Salvia L.) techniką GC-MS M. Sajewicz1,

Prezentacja na temat: "Porównanie różnych metod wyodrębniania lotnych substancji organicznych zawartych w wybranych gatunkach szałwii (Salvia L.) techniką GC-MS M. Sajewicz1,"— Zapis prezentacji:

1 Porównanie różnych metod wyodrębniania lotnych substancji organicznych zawartych w wybranych gatunkach szałwii (Salvia L.) techniką GC-MS M. Sajewicz1, J. Rzepa1, Ł. Wojtal1*, D. Staszek1, M. Hajnos2, T. Kowalska1, M. Waksmundzka-Hajnos3 1Instytut Chemii, Uniwersytet Śląski, Szkolna 9, Katowice 2Katedra Farmakognozji, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Chodźki 1, Lublin 3Katedra Chemii Nieorganicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Staszica 6, Lublin Tab.1. Porównanie zawartości lotnych substancji organicznych zawartych w Salvia lavandulifolia L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało się przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng); (d) ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Pogrubioną czcionką zaznaczono marker chemotaksonomiczny (β-mircen) oraz wskaźniki chemotaksonomiczne (β-trans-ocymen i tujon). Związek lotny -Pinen Kamfen -Pinen -Mircen o-Cymen Limonen -Felandren -trans-Ocymen Eukaliptol Cis-Ocymen -Terpinen p-Menta-1.4-dien Tujol Tujenon Tujon Kamfora Borneol Octan bornylu -Chamigren Cadina-3.9-dien Murolen Izo kariofilen Kariofilen Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Czas retencji [min] 10.97 11.75 12.20 12.25 13.15 13.26 13.32 13.36 13.50 13.91 13.95 14.59 15.12 15.35 15.47 16.11 16.65 18.84 21.60 22.43 23.31 21.70 22.53 Względna wysokość pików (%) HS-70 7.22 16.15 2.82 ++ 21.33 1.74 0.09 2.47 13.08 19.03 3.77 1.63 0.15 1.02 HS-80 8.09 10.27 8.28 14.00 0.21 0.06 9.67 5.67 10.37 7.18 5.46 1.42 4.33 Deryng 4.13 2.25 1.08 12.70 0.28 9.22 2.88 9.02 7.40 3.26 7.64 ASE 1.80 0.46 13.44 7.52 49.95 0.85 3.30 WPROWADZENIE Nazwa szałwii wywodzi się z łacińskiego słowa salvere i oznacza „być w dobrym zdrowiu”. Szałwia znana była już w starożytnej Grecji ze względu na swoje właściwości lecznicze i kulinarne. W średniowieczu ceniono ją jako ziele uniwersalne – podtrzymujące życie człowieka. Staropolskie przysłowie mówi: „Tego śmierć nie ubodzie, kto ma szałwię w ogrodzie”. Stosowano ją jako lek na przeziębienia, gorączkę, padaczkę, choroby wątroby i zaparcia. Uważano ją również za afrodyzjak. Na kuli ziemskiej znanych jest około 900 gatunków szałwii. MATERIAŁ ROŚLINNY Próbki szałwii (S. lavandulifolia L., S. staminea L. i S. triloba L. ) zostały zebrane w Ogrodzie Roślin Leczniczych Katedry Farmakognozji UM w Lublinie dn. 20 sierpnia 2007 r. Materiał roślinny suszono w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze °C przez ok. 40 h. Otrzymany materiał przechowywano do czasu analizy w stanie zamrożenia. Następnie odważono 2g (head space i ASE) oraz 50 g (destylacja z parą wodną w aparacie Derynga) suszu liści każdego gatunku rośliny i próbki te roztarto w moździerzu porcelanowym. CHROMATOGRAFIA GAZOWA Z DETEKCJĄ MASOWĄ (GC-MS) Chromatograf gazowy TRACE 2000 z detektorem mas MS TRACE Finnigan (firmy Thermo Quest) oraz autosamplerem Combi PAL (firmy CTC), programem do sterowania aparaturą, akwizycji i obróbki danych X-Calibur i biblioteką widm masowych NIST. Kolumna kapilarna: DB-5 30 m • 0,25 mm • 0,25 µm Gaz nośny: Hel o ciśnieniu p=100 kPa Program temperatury: 40°C (3 min); 40 do 150°C ( 8°/min), izotermicznie 150°C (15 min) Temperatura dozownika: 150°C Energia jonizacji: 70 eV Wygrzewanie próbek: 70 oraz 80°C (15 min) Temperatura interfejsu: 200°C Temperatura źródła jonów: 180°C TECHNIKI WYODRĘBNIANIA LOTNYCH SUBSTANCJI ORGANICZNYCH Z ROŚLINY Desorpcja z fazy nadpowierzchniowej Head space jest prostą i efektywną metodą izolacji lotnych substancji zarówno z materiału stałego, jak i ciekłego. Temperatury desorpcji: 70 i 80°C. Czas wygrzewania: 15 min. Próbka gazowa była dozowana na GC-MS w objętości 0,5 mL przy użyciu autosamplera. Destylacja z parą wodną w aparacie Derynga W kolbie okrągłodennej o pojemności 1000 ml umieszczono 50g materiału roślinnego. Następnie do kolby wlano 400 ml wody redestylowanej i prowadzono destylację w aparacie Derynga przez 3 h. Destylat dozowano na GC-MS w ilości 1µL. Procedura ta jest opisana w Farmakopei Polskiej VI [2]. Ciśnieniowa Ekstrakcja Cieczowa - Accelerated Solvent Extraction (ASE) Warunki pracy aparatu ASE 200 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) : Przepłukiwanie : 60 s Rozpuszczalnik : eter naftowy Cykle statyczne : 3 Temperatura pieca : 105 OC Ciśnienie : 6.67 MPa Czas wygrzewania : 5 min Czas ekstrakcji statycznej : 10 min Siła płukania : 100%. Każdy ekstrakt był przechowywany w temperaturze -6oC przez 24h w celu pozbycia się substancji balastowych. Następnie były one filtrowane przez filtry strzykawkowe i w ilości 1µL analizowane techniką GC-MS. OBSERWACJE I WNIOSKI Celem badań było porównanie metod wyodrębniania lotnych substancji z materiału roślinnego, a następnie identyfikacja tych związków i oszacowanie zawartości w różnych gatunkach szałwii (Salvia L.). Desorpcję prowadzono w temperaturze 70 i 80°C. Przy 70°C rozdział badanych związków był dobry, natomiast przy 80°C następowało jego pogorszenie (gorszy rozdział sąsiadujących ze sobą pasm), co niekorzystnie wpływało na identyfikację i liościowe porównywanie zawartości poszczególnych substancji. Dlatego niższa temperatura okazała się korzystniejsza dla techniki head-space. Zawartość olejku eterycznego, którą otrzymano przy pomocy destylacji z parą wodną w aparacie Derynga wyniosła dla Salvia lavandulifolia i Salvia triloba około 1%. Dla pozostałych gatunków zawartość olejku była znacznie mniejsza. Destylacja z parą wodną w aparacie Derynga bardzo dobrze nadaje się do wyodrębniania olejków z materiału roślinnego nie tylko dla roślin zawierających duże ilości oleistych substancji lotnych. ASE z użyciem eteru naftowego nadaje się do ekstrakcji roślin zawierających dużą ilość oleistych substancji. PODSUMOWANIE Najwięcej związków udało się zidentyfikować przy pomocy desorpcji z fazy nadpowierzchniowej w temperaturze 70°C, jednak destylacja z parą wodną w aparacie Derynga przyniosla niewiele gorsze rezultaty. Najczęściej występujące związki w badanych gatunkach szałwii to: -pinen, -pinen, tujol, -chamigren, cadina-3,9-dien. Substancje, które występowały w stosunkowo znacznym stężeniu, to: kamfen, eukaliptol, tujol, kamfora, β-chamigren, murolen, izokariofilen. Salvia lavandulifolia okazała się gatunkiem, w którym prawie każda technika wykryła charakterystyczne dla niej związki lotne, m.in. β-mircen, β-trans-ocimen i tujon. Rys.1. Porównanie chromatogramów próbek Salvia lavandulifolia L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało się przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użycien autosamplera (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng); (d) ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Nazwy zidentyfikowanych związków podano w Tab.1. HS-70 HS-80 Deryng ASE Tab.2. Porównanie zawartości lotnych substancji organicznych zawartych w Salvia triloba L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng), (d) ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Pogrubioną czcionką zaznaczono wskaźnik chemotaksonomiczny (tujon). Związek lotny -Pinen Kamfen -Pinen -Mircen o-Cymen Limonen -Felandren -trans-Ocymen Eukaliptol Cis-Ocymen -Terpinen p-Menta-1.4-dien Tujol Tujenon Tujon Kamfora Borneol Octan bornylu -Chamigren Cadina-3.9-dien Murolen Izo kariofilen Kariofilen Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Czas retencji [min] 10.97 11.75 12.20 12.25 13.15 13.26 13.32 13.36 13.50 13.91 13.95 14.59 15.12 15.35 15.47 16.11 16.65 18.84 21.60 22.43 23.31 21.70 22.53 Względna wysokość pików (%) HS-70 11.59 0.28 23.40 17.81 17.75 0.38 0.21 HS-80 7.41 4.23 14.71 11.05 10.91 11.18 2.52 8.53 6.22 Deryng 4.22 0.47 11.09 7.96 8.14 4.89 4.38 10.99 8.80 ASE 10.25 24.92 8.78 28.89 5.55 5.77 Rys.2. Porównanie chromatogramów próbek Salvia triloba L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało się przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng); (d) ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Nazwy zidentyfikowanych związków podano w Tab.2. HS-70 HS-80 Deryng ASE Tab.3. Porównanie zawartości lotnych substancji organicznych zawartych w Salvia staminea L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało się przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng); (d) ciśnieniowej ekstrakcii cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Pogrubioną czcionką zaznaczono wskaźnik chemotaksonomiczny (tujenon). Związek lotny -Pinen Kamfen -Pinen -Mircen o-Cymen Limonen -Felandren -trans-Ocymen Eukaliptol Cis-Ocymen -Terpinen p-Menta-1.4-dien Tujol Tujenon Tujon Kamfora Borneol Octan bornylu -Chamigren Cadina-3.9-dien Murolen Isokariofilen Kariofilen No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Retention time [min] 10.97 11.75 12.20 12.25 13.15 13.26 13.32 13.36 13.50 13.91 13.95 14.59 15.12 15.35 15.47 16.11 16.65 18.84 21.60 22.43 23.31 21.70 22.53 Wysokość profili stężeniowych (%) HS-70 10.09 4.86 5.23 15.68 3.58 2.30 3.33 0.69 2.98 1.41 HS-80 8.75 2.47 5.39 6.24 1.12 0.29 8.39 2.19 Deryng 2.64 3.05 5.57 3.93 0.54 0.41 0.30 0.97 10.21 6.30 ASE 13.17 4.70 Rys.3. Porównanie chromatogramów próbek Salvia staminea L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało się przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng); (d) ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Nazwy zidentyfikowanych związków podano w Tab.3. HS-70 HS-80 Deryng ASE LITERATURA 1. M. Sajewicz, J. Rzepa, M. Hajnos, Ł. Wojtal, D. Staszek, T. Kowalska, M. Waksmundzka-Hajnos. Acta Chromatogr., 21(3), 2009 (w druku) 2. Farmokopea Polska VI, Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne, Warszawa, 2002 *Praca jednego z autorów (Łukasz Wojtal) jest od 2008 r. częściowo wspomagana przez stypendium projektu „Uniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzy”, współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.