Oddziaływanie ludzkiej topoizomerazy I z białkami Krzysztof Staroń styczeń 2006
Problemy topologiczne dwuniciowego DNA B A
Ludzkie topoizomerazy
Mechanizm relaksacji DNA przez topoizomerazę I (1)
Mechanizm relaksacji DNA przez topoizomerazę I (2)
Kamptotecyna Topotecan (Hycamtin®) Irinotecan(Camptosar®)
Struktura ludzkiej topoizomerazy I NT CR LK CT Cap Subdomain III 1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III Struktura ludzkiej topoizomerazy I
Aktywności topoizomerazy I Kinazowa Nacinanie DNA Relaksacyjna ASF/SF2 1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III CPT - + Relaksacyjna pBR322
Substraty aktywności kinazowej topoizomerazy I Splicing factor SFRS4 (SRp75) Splicing factor SFRS6 (SRp55) Splicing factor SFRS5 (SRp40) Splicing factor ASF/SF2 (SRp30a) Splicing factor SC35 (SRp30b) Splicing factor SFRS9 (SRp30c) P P P P P P P | | | | | | | ...SYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSR...
Identyfikacja partnerów białkowych ludzkiej topoizomerazy I
Koimmunoprecypitacja MS analysis SDS-PAGE Koimmunoprecypitacja
Poliklonalne przeciwciała Koimmunoprecypitacja 1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III Poliklonalne przeciwciała anty-topo I
Chromatografia powinowactwa MS analysis SDS-PAGE
Chromatografia powinowactwa SDS-PAGE NT CR LK CT HeLa nuclear extract 1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III HeLa nuclear extract + - resin GST M.W.
Identyfikacja partnerów topoizomerazy I NT CR LK CT Cap Subdomain III 1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III Fibrillarin AAH19260 RNA processing N-acetylotransferase BAB13995 Acetylation B23 nucleophosmin CAA34809 Ribosome biogenesis DNA-PK A57099 Transcription, DNA repair DEAH 68 protein 1406327A RNA metabolism H1d NP_005310 Chromatin structure H1X NP_006017 Chromatin structure hnRNP A1 P09651 RNA metabolism hnRNP A2/B1 NP_112533 RNA metabolism hnRNP C NP_004491 RNA metabolism hnRNP R NP_005817 RNA metabolism hnRNP U S22765 RNA metabolism Hu R NP_001410 RNA metabolism Ki-67 P46013 Proliferation NDH II Q08211 RNA metabolism Nopp140 P41777 Nucleologenesis nucleolin NP_005372 Ribosome biogenesis p120 AAA36398 Proliferation PARP-1 P09874 DNA repair RH II/Gu AAF78930 RNA metabolism RH p72 Q92841 RNA metabolism SF2/ASF Q07955 RNA splicing TCOF1 AAH27252 Ribosome biogenesis Topo II A40493 Topology control U2snRNP A' NP_003081 RNA splicing U5snRNP 100 AAB87902 RNA splicing U5snRNP 116 Q15029 RNA splicing U5snRNP 200 NP_054733 RNA splicing U5snRNP 220 NP_006436 RNA splicing B23 nucleophosmin CAA34809 Ribosome biogenesis DEAH 68 protein 1406327A RNA metabolism H1d NP_005310 Chromatin structure H1X NP_006017 Chromatin structure hnRNP A1 P09651 RNA metabolism hnRNP A2/B1 NP_112533 RNA metabolism hnRNP A3 AAQ63629 RNA metabolism hnRNP C NP_004491 RNA metabolism hnRNP K P61978 RNA metabolism hnRNP L P14866 RNA metabolism hnRNP R NP_005817 RNA metabolism hnRNP U S22765 RNA metabolism Hu R NP_001410 RNA metabolism NDH II Q08211 RNA metabolism nucleolin NP_005372 Ribosome biogenesis p54nrb Q15233 RNA splicing PARP-1 P09874 DNA repair PSF CAA50283 RNA splicing RH II/Gu AAF78930 RNA metabolism RH p72 Q92841 RNA metabolism SF2/ASF Q07955 RNA splicing SF3b130 NP_036558 RNA splicing SF3b155 NP_036565 RNA splicing Topo II A40493 Topology control
Białka oddziałujące z topoizomerazą I zidentyfikowane we wcześniejszych pracach Znalezione w tej pracy: H1d H1x nucleolin PARP-1 PSF p54nrb SF2/ASF fibrillarin Nieznalezione w tej pracy: ARF CK2 PCNA RNA polymerase II TBP topors WRN p53
Wzajemne oddziaływania między białkami wiążącymi się do topoizomerazy I (baza HPRD) PARP-1 hnRNP A3 nucleolin fibrillarin RHp72 (DDX17) RHp68 (DDX5) RHII/Gu (DDX21) hnRNP U B23 H1d H1x hnRNP A1 hnRNP C hnRNP K hnRNP L hnRNP A2/B1 Hu R hnRNP R PSF DNA-PKcs NDHII (DDX9) Topo IIa SF2/ASF p54nrb U5snRNP 116 U5snRNP 100 U5snRNP 200 U5snRNP 220 SF3B 155 SF3B 130 U2snRNP A’ Ki 67 Nopp 140 TCOF 1 p120 N-acetylotranferase
Funkcje białek wiążących się do topoizomerazy I Splicing and RNA metabolism Ribosome biogenesis and nucleologenesis DNA repair Proliferation Chromatin structure Other
215 434 Cap B. Białka wiążące się do rejonu cap
rejonu cap i posiadające 215 434 Cap B23 nucleophosmin H1X hnRNP A1 hnRNP A2/B1 hnRNP A3 hnRNP C hnRNP K hnRNP L hnRNP R hnRNP U Hu R NDH II nucleolin PARP-1 p54nrb PSF RH II/Gu RHp68 RH p72 SF2/ASF SF3b130 SF3b155 Topo II Białka wiążące się do rejonu cap i posiadające tandem domen RRM
Domena RRM 215 434 Cap Wiązanie RNA Wiązanie białek UHM
215 434 Cap Białko SF2/ASF DGPRSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSYSPRRSRGSPRYSPRHSRSRSRT 1 120 195 248
Mapowanie miejsc wiązania białka SF2/ASF na topoizomerazie I 215 434 Cap Mapowanie miejsc wiązania białka SF2/ASF na topoizomerazie I 1 215 636 434 713 765 1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III ?
Mapowanie miejsc wiązania topoizomerazy I na białku SF2/ASF 215 434 Cap Mapowanie miejsc wiązania topoizomerazy I na białku SF2/ASF 215 434 Cap 1 195 control 248 1 195 120 1 765
Dokowanie białek z tandemem RRM na topoizomerazie I 215 434 Cap Dokowanie białek z tandemem RRM na topoizomerazie I p54nrb SF2/ASF
Dokowanie SF2/ASF na topoizomerazie I bez DNA i w obecności DNA 215 434 Cap Dokowanie SF2/ASF na topoizomerazie I bez DNA i w obecności DNA - DNA + DNA
Konkurencja między tandemem RRM a DNA: wiązanie do cap 215 434 Cap Konkurencja między tandemem RRM a DNA: wiązanie do cap 215 434 GST + DNA
Odwracanie nacinania DNA przez SF2/ASF 215 434 Cap SF2/ASF + camptothecin -
Konkurencja między tandemem RRM a DNA: hamowanie nacinania DNA w obecności kamptotecyny 215 434 Cap control
Wzajemne hamowanie aktywności topoizomerazy I przez substraty obu reakcji 215 434 Cap SF2/ASF + camptothecin - Fosforylacja H Relaksacja DNA CPT
Wybór białek do analizy Y2H 215 434 Cap Wybór białek do analizy Y2H hnRNP A1 hnRNP A2/B1 hnRNP A3 hnRNP L Hu R p54nrb PSF SF2/ASF hnRNP R nucleolin
PARP-1 hnRNP A3 nucleolin fibrillarin RHp72 (DDX17) RHp68 (DDX5) RHII/Gu (DDX21) hnRNP U B23 H1d H1x hnRNP A1 hnRNP C hnRNP K hnRNP L hnRNP A2/B1 Hu R hnRNP R PSF DNA-PKcs NDHII (DDX9) Topo IIa SF2/ASF p54nrb U5snRNP 116 U5snRNP 100 U5snRNP 200 U5snRNP 220 SF3B 155 SF3B 130 U2snRNP A’ Ki 67 Nopp 140 TCOF 1 p120 N-acetylotranferase Topo I
1 215 NT C. Białka wiążące się do domeny N-końcowej
Phage display (PhD) 1 215 NT DNA sequencing
PhD dla domeny N-końcowej 1 215 NT PhD dla domeny N-końcowej KLWVIPQ KLWVLPK KLWQVFP KVWILTP KVWTIPR KVWYITP KVWDLRS KCCYIPT KGPPITR YVTREPR Ky[WC]xxP DNA-PK
Indukcja apoptozy przez DNA-PK 1 215 NT Indukcja apoptozy przez DNA-PK
1. Kowalska-Loth, B. , Girstun, A. , Piekiełko A. , Staroń, K. (2002) 1. Kowalska-Loth, B., Girstun, A., Piekiełko A., Staroń, K. (2002). SF2/ASF protein inhibits camptothecin-induced DNA cleavage by human topoisomerase I. Eur. J. Biochem. 269, 3504-3510. 2. Trzcińska, A.M., Girstun, A., Kowalska-Loth, B., Staroń, K. (2002) Potential protein partners for the N-terminal domain of human topoisomerase I revealed by phage display. Mol. Biol. Rep. 29, 347-352. 3. Czubaty, A., Girstu, A., Kowalska-Loth, B., Trzcińska, A.M., Purta, E., Winczura, A., Grajkowski, W., Staroń, K. (2005) Proteomic analysis of complexes formed by human topoisomerase I. Biochim. Biophys. Acta 1749, 133-141. 4. Kowalska-Loth, B., Girstun, A., Trzcińska, A.M., Piekieko-Witkowska, A., Staroń, K. (2005) SF2/ASF protein binds to the cap region of human topoisomerase I through two RRM domains. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 398-403.
Agnieszka Girstun, Alicja Czubaty, Krzysztof Staroń, Agata M Agnieszka Girstun, Alicja Czubaty, Krzysztof Staroń, Agata M. Trzcińska, Barbara Kowalska-Loth Wojciech Grajkowski, Aleksander Jamsheer, Agnieszka Piekiełko-Witkowska, Elżbieta Purta, Alicja Winczura oraz: