Chromatyna a epigenetyka

Chromatyna wypełnia jądro komórkowe Chromatyna - kompleks nukleoproteinowy DNA, histony, białka niehistonowe Funkcja strukturalna oraz regulacyjna W jadrze nie ma nagiego DNA tylko chromatyna, co wpływa decydujaco na przebieg zachodzacych w nim procesow:replikacja, transkrypcja itd… , zaburzenia wystepuja w wielu chorobach, m.in. nowotworach

23 ludzkie chromosomy w jądrach fibroblastów we wczesnej profazie

Maksymalny stopień kondensacji DNA osiąga w chromosomach W jadrze interfazowym jest bardziej rozluzniona

Białka histonowe Histony-uniwersalne u eukariota (jaki jest wyjątek? - protaminy) Małe, zasadowe – lizyna i arginina Domeny globularne- rownomiernr rozmieszczenie ladunku,; odpowiedzialne za oddziaływania międzyhistonowe histonow rdzeniowych oraz wiazanie z DNA ;ogony sa zasadowe , w H1 N i C końcowe Bardzo konserwowane – najbardziej H4, 2 różnice miedzy krową i grochem. Ogony sa bardziej zmienne szczególnie w H1, H2A i H2B Różnice w sekw aa sa podstawa do wyroznienia wariantow sekwencyjnych , szczególnie duzo dla h1, brak dla H4. są kodowane przez odrebne geny.

Dean Hewish, 1973 Leigh Burgoyne, 1973 Chromatyna trawiona nukleazą, oryginał z pracy Hewish and Burgoyne 1973 Dean Hewish, 1973 Leigh Burgoyne, 1973

Trawienie chromatyny MNazą - drabinka nukleosomowa Mono, di, tri nukleosomy itd. Dlugie trawiienie ujawnia chromatosom i cz. Rdzeniowa – coraz krotsze DNA

„Sznur korali” (‘beads on the string’) Olins & Olins, 1973 http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/N/Nucleus.html

NUKLEOSOM JEST PODSTAWOWĄ JEDNOSTKĄ STRUKTURALNĄ CHROMATYNY Roger Kornberg w 1974 r. zaproponował model, w którym DNA owinięty jest wokół rdzenia histonowego tworząc nukleosom NUKLEOSOM JEST PODSTAWOWĄ JEDNOSTKĄ STRUKTURALNĄ CHROMATYNY aureat Nagrody Nobla w dziedzinie chemii w 2006 9

Fałd histonowy Charakt motyw strukturalny dla hist rdzeniowych odpowiada za interakcje histonow oktameru w nukleosomie Ok. 70aa, 3 helisy i krótkie łączniki

Złożenie fałdów (hand shake) Silne oddziaływanie

Konserwowane elementy na obrzeżu oktameru Odpowiedzialne za interakcje histony-DNA

Oktamer – oddziaływanie z DNA Podstawową, powtarzalną jednostką strukturalną chromatyny jest nukleosom. W budowie nukleosomu można wyróżnić tzw. cząstkę rdzeniową – zwartą strukturę w kształcie spłaszczonego cylindra, złożoną z ośmiu cząsteczek histonów (po dwie cząsteczki histonów H2A, H2B, H3 i H4) na które nawinięty jest fragment DNA. Ogony wystaja na zewnatrz nukleosomu

Mutacje SIN znoszą oddziaływania oktameru z DNA SIN (SWI/SNF independent) powoduja zmiane struktury chromatyny

Składanie nukleosomu Nukleosom = H3H4 tetramer + 2 dimery H2AH2B Udział czaperonow przy składaniu

Zaginanie i zwijanie DNA na oktamerze Samo nawiniecie dna na oktamery wymusza pewna konformacje DNA Ściśle zwinięta lewoskrętna superhelisa ma ok. 80 pz na zwój i skok superhelikalny ok. 27,5 A.

Ekspozycja miejsc w helisie DNA na oktamerze Jedne fragmenty sa skierowane do wewnatrz, inne na zewnatrz nukleosomu

Struktura krystalogtaficzna cząstki rdzeniowej nukleosomu Karolin Luger Timothy Richmond Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Nature 1997 Sep18;389(6648):251-60 18

Schemat nukleosomu

Nukleosomy - terminologia 8 histonów: Po dwa każdego z: H2A H2B H3 H4 Gräff and Mansuy (2008). Behav Brain Res.

Organizacja chromatyny Podwójna helisa DNA 2 nm Histony + DNA. “Koraliki na sznurku” f 11 nm Komórka roślinna Włókna nukleosomowe 30-nm (solenoid) 30 nm Włókna połączone z macierzą jądrową 300 nm Nuclear Matrix

Umiejscowienie H1 w nukleosomie Albo wiaże się w jednym miejscu na DNA (po lewej) albo spina DNA lacznikowy w miejscu wejscia i zejscia

Regulacyjna rola chromatyny Struktura chromatyny nie jest jednolita, tzn. w jądrze komórkowym obok siebie występują regiony o niskim oraz wysokim stopniu kondensacji nazywane tradycyjnie eu- i heterochromatyną

Struktura a funkcja chromatyny Połączone ze sobą nukleosomy tworzą w roztworach o małej sile jonowej włókno chromatynowe o średnicy 10nm, które w warunkach fizjologicznych spontanicznie fałduje się w grubsze włókno o średnicy 30nm. Nie wyjaśniono do tej pory, jak zbudowane są struktury chromatyny wyższego rzędu Rola histonu H1 i ogonów rdzeniowych Różne formy chromatyny mogą wzajemnie miedzy soba przechodzic – zmiany te sa regulowane i decydują o przebiegu procesów genetycznych (np.. Transkrypcji ) w jądrze

Zmiany struktury chromatyny modyfikacje DNA modyfikacje potranslacyjne histonów wyspecjalizowane warianty histonów ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny

Metylacja DNA, Metylomy

Metylacja DNA zamienia cytozynę w 5-metylo cytozynę

Metylacja DNA ma znaczenie biologiczne Arabidopsis 46-dni od wysiania O N NH2 ~ CH3 cytosine 5-methylcytosine Methyltransferase WT met1/cmt3 Xiao, et al.(2006). The Plant Cell. 18: 805-814

Metylacja DNA u eukariontów Nie jest uniwersalna, występuje u ssaków i roślin kwiatowych Jest zmienna gatunkowo, tkankowo i chromosomowo Rozpoznawana przez rodzinę białek zawierających domenę (MBD) wiążącą metylowany DNA Ściąga kompleksy białkowe indukujące zmiany w lokalnej strukturze chromosomów Wyłącza ekspresję genów Zakłócenia w normalnym wzorze metylacji DNA są niemal powszechnie wykrywane w nowotworach

Transpozony Fragmenty DNA, które mogą się wstawiać w nowe miejsce w chromosomie Niektóre są zdolne do autokopiowania, co prowadzi do wzrostu ich ilości w genomie Odpowiadają za wielkoskalowe zmiany w chromosomach, jak również pojedyncze wydarzenia mutacyjne

U roślin program epigenetyczny wycisza transpozony i chroni integralość centromerów

Transpozony mogą powodować wyłączenie lub niestabilność alleli Allel dziki Ziarniak barwny Allel zmutowany Ziarniak bezbarwny Allel niestabilny Ziarniak częściowo zabarwiony Wycięcie transpozonu powoduje niestabilność allelu Gen biosyntezy barwnika Gen rozbity przez transpozon

Metylacja DNA jest niezbędna do wyciszania transpozonów Brązowy = Metylowany DNA w mutancie met1 Niebieski = gęstość genów Czerwony = Gęstość elementów powtarzalnych Zielony = Metylowany DNA Utrata funkcji met1 lub ddm1 (decrease in DNA methylation1) mutanty mają niedometylowany DNA Zhang, et al. (2006). Cell 126: 1189-1201

Metylotransferazy DNA w Arabidopsis MET1 (METHYLTRANSFERASE1) Miejsca 5'-CG-3' Wyciszanie transpozonów, elementów powtórzonych, piętnowanie genów (imprinting) CMT3 (CHROMOMETHYLASE3) Miejsca 5'-CHG-3' (H= A, C or T) Oddziaływanie z modyfikakcjami histonów DRM 1, DRM 2 (DOMAINS REARRANGED 1 and 2) Miejsca 5'-CHH-3' Metyluje głównie elementy powtarzalne Wymaga aktywnej indukcji przez siRNA

Aktywacja transpozonów w mutancie ddm1 indukuje mutacje Po wyłączeniu DDM1, fenotyp rośliny staje się coraz bardziej nienormalny, w miarę akumulowania indukowanych przez transpozony. Dziki Po 1 pokoleniu Po 3 pokoleniach Po 5 Kakutani, et al. (1996). PNAS. 93: 12406-12411

Lokalizacja ogonów histonowych w nukleosomie H2A H2A H2B H2B

Enzymy modyfikujące histony i DNA HAT – acetylotransferazy histonów (bromodomena) HDAC – deacteylazy histonów HMT – metylotransferazy histonów (chromodomena). CMT3 – DNA metylotransferaza (chromodomena)

Przykład kowalencyjnej modyfikacji aminokwasów -acetylacja lizyny

Elektroforetyczny dowód acetylacji histonów

Efekt acetylacji ogonów histonowych Inhibitory deacetylaz – leki przeciwnowotworowe i w chorobach OUN

Modyfikacje potranslacyjne białek histonowych Kozaurides 2007

Modyfikacje a struktura chromatyny H3 K9 diME H3 K9 diME euchromatyna heterochromatyna

Modyfikacje histonów * * * k6 Biotinylation ADP-ribosylation k11 Gräff and Mansuy (2008). Behav Brain Res.

Po-translacyjne modyfikacje histonów w nukleosomie wg. B Po-translacyjne modyfikacje histonów w nukleosomie wg. B.Turner, Cell 2002

Mechanizm działania modyfikacji potranslacyjnych białek histonowych Działanie bezpośrednie: zmiany w oddziaływaniach histon-DNA i histon-histon Działanie pośrednie: rekrutacja białek rozpoznających określone modyfikacje Kozaurides 2007

Przykład przeciwstawnych funkcji modyfikacji histonów H3/H4 AcLys/H3metLys4(H3K4) - związane z rejonami aktywnej transkrypcji H3/H4 Lys+/H3metLys9 (H3K9) - związane z rejonami wygaszonej transkrypcji.

Determinanty aktywnej i wyciszonej chromatyny

Euchromatyna i heterochromatyna Mniej skondensowana Głównie w ramionach chromosomów Zawiera unikatowe sekwencje Bogata w geny Silnie skondensowana Głównie w centromerach i telomerach Zawiera powtórzone sekwencje Uboga w geny http://www.nyas.org/

Znaczniki epigenetyczne związane ze stanami chromatyny ATP-zależna przebudowa chromatyny ATP-zależna przebudowa chromatyny ATP-dependent chromatin remodeling

Warianty histonów – H2A Warianty h1- rozna dynamika wiazania z chromatyna

Warianty histonów - rozmieszczenie w chromosomach

SWI/SNF ISWI Mi2 Snf2 ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny Główne typy kompleksów remodelujących chromatynę SWI/SNF ISWI Mi2 Swp73 Swi3 Snf5 Snf2 ISWI

Działanie kompleksów remodelujących chromatynę Kingston & Narlikar, 1999

ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny Jeden z mechanizmów remodelingu: przesunięcie oktameru histonów wzdłuż nici DNA

Przykład „przebudowy” (remodelingu) chromatyny Pozycja skrajna Pozycja centralna

Pozycjonowanie nukleosomów

Nukleosomy zajmują określone miejsca w chromatynie A. Schemat ułożenia nukleosomów w chromatynie, pojęcie długości powtórzeń nuklesomowych. B. Silnie zlokalizowane i rozmyte nukleosomy. C. Nukleosomy a miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych. G. Arya et al. jbsd 2010

Nukleosomy a transkrypcja Schemat otwartych (A) i zamkniętych (B) promotorów. Typowa mapa pozycyjna nukleosomów na otwartym promotorze pokazuje wyraźne wyróżnienie locus genowego przez obecność rejonów 5’ i 3’ wolnych od nukleosomów (NDR). (TSS) - miejsce startu transkrypcji. 5’ NDR sąsiaduje z silnie związanymi nukleosomami. G. Arya et al. jbsd 2010

Dziedziczenie epigenetyczne Dziedziczne modyfikacje funkcji genów nie związane ze zmianami w sekwencji DNA Mechanizmy epigenetyczne są związane z modulacją chromatyny i obejmują: modyfikacje histonów, metylację DNA, przebudowę nukleosomów (remodeling), system RNAi.

Epigenetyka Dziedziczenie właściwości (np. wzoru ekspresji genów) poprzez mitozę, nie wymagające zmian w sekwencji DNA. Genetyka Epigenetyka Allis, et al.(2007).Epigenetics, overview and concepts. CSHL.

Istota modyfikacji epigenetycznej

Dezaktywacja chromosomu X polega na wyciszeniu epigenetycznym U samic ssaków, w każdej komórce jedna z kopii chromosmu X jest epigenetycznie wyłączona X XX U samic ssaków, w każdej komórce jedna kopia chromosomu X jest wyciszona epigenetycznie. Kolor futra u kotów jest częściowo determinowany przez gen orange, położony w chromosomie X. Samica, która jest heterozygotą w genie orange, wykazuje czarne i pomarańczowe plamy, które odpowiadają komórkom, z genem wyłączonym w jednym lub drugim chromosomie.

Dlaczego sklonowany kot nie jest dokładnie taki, jak oryginał? Rainbow Klon Rainbow

U bliźniąt monozygotycfznych różnice epigenetyczne (metylacja DNA) nagromadzają się w życiu osobniczym Istotne różnice w metylacji DNA pokazane są jako grube czerwone i zielone rejony na ideogramach. Para 50-letnich bliźniaków wykazuje liczne zmian e we wzorze metylacji DNA (zielone=hipermetylacja; czerwone=hipometylacja), 3-letnie bliźnięta maja bardzo podobny wzór metylacji (żółte). "...Stwierdziliśmy, że choć monozygotyczne bliźnięta są epigenetycznie nierozróżnialne we wczesnych latach życia, w starszym wieku wykazują znaczące różnice w zawartości i rozkładzie 5-metylocytozyny w DNA oraz w acetylacji histonów, co wpływa na profil ekspresji ich genów. Pokazuje to jak bardzo niedoceniamy znaczenia epigenetyki w powstawaniu różnych fenotypów z tego samego genotypu." Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jul 26;102(30):10604-9. Copyright (2005) National Academy of Sciences, U.S.A

Fenotyp mutantów w metylotransferazie histonów Mutanty są pozbawione metylacji w H3K36. Dong, et al. (2008). Biochemical and Biophysical Research Communications. 373: 659-664

Epigenetyczna kontrola czasu kwitnienia Przedłuzony okrers chłodu Rozwój wegetatywny Rozwój generatywny Jesień Zima Wiosna Niektóre rośliny wymagają przedłużonego okresu chłodu (wernalizacji) – w trakcie zimy, zanim będą mogły zakwitnąć.

FLC hamuje FT, aktywator kwitnienia Roślina dzika FLC Gen FT Związanie FLC hamuje transkrypcję FT Roślina z mutacją flc Gen FT FT

Mutanty w genie FLOWERING LOCUS C (FLC) kwitna wcześnie Jesień Zima Wiosna FLC jest inhibitorem kwitnienia; brak FLC znosi konieczność wernalizacji.

FLC jest wyciszany w trakcie wernalizacji Po 40 dniach w 4°C , FLC nie jest wyrażany. 10 dni po powrocie do 22°C ekspresja FLC jest wciąż wyłączona. Jesień Zima Wiosna FLC transkrybowany FLC wyciszony Sung, et al. (2004). Nature. 427: 159-164.

FLC jest regulowany przez modyfikacje epigenegtyczne H3k4me H3K36me H3K9ac H314ac H3k9me2 H3k27me2 Zimno Jesień Zima Wiosna FLC transkrybowany FLC wyciszony

Kompleksy VIN3 i PRC2 epigenetycznie wyłączają FLC PRC2= Polycomb Represive Complex 2) VIN3 PRC2 (łącznie z VIN3) Jesień Zima Wiosna FLC transkrybowany FLC wyciszony

Program epigenetyczny wspomaga przejścia rozwojowe u roślin Przejście z fazy embrionalnej do wegetatywnej Przejście z fazy wegetatywnej w generatywną Rozwój embrionalny Rozwój wegetatywny Rozwój generatywny

Przykład ewolucyjnego efektu epimutacji (zmiany we wzorze metylacji DNA) Lcyc kontroluje symetrię grzbietowo-brzuszną kwiatu; u mutanta nieaktywny z powodu silnej, dziedziczonej metylacji From Cubas et al 1999, Nature 401: 157-161