Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku wodnym: jeszcze raz fototautomeria. Jacek Wierzchowski Katedra Fizyki i Biofizyki UWM w Olsztynie.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku wodnym: jeszcze raz fototautomeria. Jacek Wierzchowski Katedra Fizyki i Biofizyki UWM w Olsztynie."— Zapis prezentacji:

1 Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku wodnym: jeszcze raz fototautomeria. Jacek Wierzchowski Katedra Fizyki i Biofizyki UWM w Olsztynie

2 2-aminopuryna N 1,N 6 -etenoadenozyna formycyna A 8-azaguanina max ~ 360 nm max ~ 410 nm max ~ 340 nm max ~ 390 nm ~ 0.6 = 0.55 = 0.08 ~ 0.08 ÷ 0.3 Najważniejsze zastosowania: Badania oddziaływań enzym-ligand oraz asocjacji białek, polinukleotydów itd. Badania dynamiki DNA i RNA Fluorymetryczne oznaczanie aktywności enzymów Fluoryzujące pochodne i analogi puryn, stosowane w badaniach enzymologicznych (przykłady).

3 Czy 8-azaksantyna fluoryzuje? Deaminaza guaninowa (GDA) działa na 8-azaguaninę, produkując 8-azaX: Gdyby produkt fluoryzował, mielibyśmy metodę oznaczania aktywności GDA. Enzym ten jest ważny klinicznie - stanowi marker zakażenia HCV! Inne możliwe pożytki z fluorescencji 8-azaX: Badanie oddziaływań z oksydazą ksantynową. 8-azaX to silny inhibitor urykazy (enzym utleniajacy kwas moczowy). Pochodne metylowe – analogi kofeiny, teofiliny etc. to potencjalne ligandy dla receptorów adenozynowych. Pierwsze podejście: produkt deaminacji 8-azaguaniny nie fluoryzuje

4 Własności kwasowo-zasadowe puryn i 8-azapuryn. ZwiązekGłówna forma anionowa pK a fluorescencja w pH 7 Guanina (G)9.2nie (forma obojętna) 8-azaG6.5tak (390 nm) – forma obojętna Ksantyna (X)7.2nie (mieszanina form) 8-azaX4.7nie (monoanion!!) Albert, A. Chemistry of 8-azapurines. Adv. Heterocycl. Chem. 1986, 39,

5 Czy forma obojętna 8-azaX (pH < 5) fluoryzuje? TAK!! ale… (), absorpcja w pH 2; ( ), absorpcja w pH 7; (), wzbudzenie fluorescencji w pH 4; (), fluorescencja w 1 mM HCl; (++++), fluorescencja w metanolu.

6 Tautomeria formy obojętnej 8-azateofiliny: Labbe G., Persoons M-A., Toppet S. Magn. Res. Chem. 25 (1985), Sanchez M.P., Romnero MA, Salas JM, Cardenas DJ, Molina J, Quiros M.. J. Mol. Struct. 344 (1995), N(8)HN(7)H DMSO: 80%<20% Kryształ:100% Wygląda na to, że główną formą 8-azaX jest forma N(8)H. Zatem czy to ona fluoryzuje? Model:

7 Fluorescencja N8-metylo-azaX: (), absorpcja w pH 3; ( ), absorpcja w pH 11; (), wzbudzenie fluorescencji w pH 3; (),wzbudzenie fluorescencji w pH 11. (), fluorescencja w 1 mM HCl; (×××), fluorescencja w pH 11; (++++), fluorescencja w metanolu. Wydajność fluorescencji (pH 9) - 60% (!!!)

8 Fluorescencja 8-azaX (--) i N 8 -m-azaX (), mierzona w 420 nm, jako funkcja pH. Wartości pK a stanu podstawowego: 4.7 (8-azaX) i ~7.2 (N8-m-azaX) Ale dlaczego fluorescencja N 8 -m-azaX poniżej i powyżej 7.2 jest identyczna?

9 Kwasowość molekuł w stanach wzbudzonych może różnić się znacznie od kwasowości w stanie podstawowym: -naftol: pK a = 9.3 pK* ~ 2.8 fluorescencja formy anionowej występuje w pH > 2.5 (obok formy obojętnej!) cykl Foerstera pozwala na obliczenie pK* na podstawie widm formy protonowanej i zdysocjowanej: ; - liczby falowe (w cm -1 ) przejść 0-0 dla obu form. Przesunięcie widm o 475 cm -1 w temperaturze 300 K oznacza pK* - pK = 1

10 Jakie jest pK* dla N8-metylo-azaX (pK a ~7.4)? cm cm -1 pK* - pK ~ - 8 (± 0.5) pK* ~ -0.5 (!!!!) Przykłady literaturowe: Związek pK a pK*ΔpK fenol β-naftol (piranina)

11 Wytłumaczenie pochodzenia fluorescencji N8-metylo-azaX w środowisku wodnym (420 nm) i metanolowym (340 nm)

12 A jeśli tak, to… Wytłumaczenie pochodzenia fluorescencji 8-azaX w środowisku wodnym i metanolowym (fototautomeria anionu!) **Zagadka: jakie jest pK* dla 8-azaX?

13 Dlaczego w środowisku wodnym nie pojawia się forma obojętna związku? dyfuzyjna stała przeniesienia protonu: V -1 = k dif 10 -pH [A - ]* k dif =5·10 10 M -1 ·s -1 (dla przeniesienia protonu) k 1 = k -1 (pH=pK*) = V -1 /[A - ]*= ·5·10 10 ·s ·10 11 s -1 ; czas przeniesienia protonu 6.3 ps. czas zaniku fluorescencji [AH]* (mierzony w metanolu): 0.85 ns

14 Czy rzeczywiście ten sam chromofor świeci w 8-azaX i N8- metylo-8azaX? Pomiary czasów zaniku fluorescencji (J. Sepioł, IChF PAN): Wnioski: a)ten sam chromofor w obu związkach i całym zakresie pH; b)w pH < 3 obserwujemy tłumienie dynamiczne.

15 Trochę wspomnień: Wierzchowski J.; Shugar, D. Luminescence studies on formycin, its aglycone, and their N- methyl derivatives: tautomerism, sites of protonation and phototautomerism. Photochem. Photobiol. 1982, 35, Wierzchowski, J.; Szczęśniak, M.; Shugar D. Fluorescence emission properties of the cation of 4- aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidine, an adenine analogue: evidence for phototautomerism. Z. Naturforsch. 1980, 35c,

16 Inne przypadki fototautomerii wśród analogów purynowych: Taylor C.A., El-Bayoumi A.A., Kasha M., 1969, PNAS 63, azaindol Wenska G.; Skalski B; Insinska M.; Paszyc S.; Verrall, R.E. Ground and excited state prototropic behavior of 1-(purin-6-yl)-3-methylimidazolium chloride. J. Photochem. Photobiol. A 1997, 108, C. Santhosh and P. C. Mishra. Electronic spectra of 2-aminopurine and 2,6-diaminopurine: phototautomerism and fluorescence reabsorption. Spectrochimica Acta Part A: Molecular Spectroscopy, 1991, 47, S. K. Srivastava and P. C. Mishra. Phototautomerism of the G---C base pair of DNA. Journal of Theoretical Biology, 93, 1981,

17 Zastosowanie w enzymologii: reakcja 8-azaX z fosforylazą ksanozynową (PNPII) z E. coli - (synteza 8- azaksantozyny -???) – B. Kierdaszuk. Puryna + rybozo-1-fosforan nukleozyd + Pi Warunki: ~100 M 8-azaX, pH ~5, 2 mM rybozo-1-fosforan, 25 C.... Reakcja idzie.... tylko czy to aby na pewno produktem jest 8-azaksantozyna???

18 ...i 9-benzylo-azaX pK a ~ 7.2;pK a ~ 5.7 Anion: absorpcja 305 nm, Anion: absorpcja 279 nm Emisja 440 nm Emisja 365 nm Porównajmy.... Nukleozyd (??)

19 Co się dzieje? N9-nukleozyd? Chyba nie! N8-nukleozyd? N7-nukleozyd? A jak reaguje PNP ze ssaków? – Brak reakcji!!

20 Dla porównania: Reakcja E. coli PNP-II z AzaGua: Porównanie widm produktu reakcji z widmami 8-azaguanozyny pokazuje, że w tym wypadku rybozylacja idzie na N-9 (z możliwą małą domieszką innych form). Dlaczego??

21 Jakie mogą być z tego pożytki? jeśli N8-metylo-azaGuanina jest substratem dla GDA….. to mielibyśmy czułą metodę analityczną dla tego enzymu W kompleksach z białkami procesy ESPT będą przebiegały inaczej niż w wodzie – jak??? Na pewno można odróżnić ligand wolny od związanego…. Aza-analogi kofeiny, teofiliny, teobrominy…… fluorescencyjne badania oddziaływań z receptorami? PNPII – pierwszy enzym rybozylujący puryny (lub analogi) w pozycji innej niż N9?? A w ogóle to dlaczego inne formy PNP rybozylują puryny na N9, jeśli N7-nukleozydy podlegają fosforolizie?

22 REKLAMA Katedra Fizyki i Biofizyki UWM ogłosi wkrótce konkurs na stanowisko asystenta


Pobierz ppt "Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku wodnym: jeszcze raz fototautomeria. Jacek Wierzchowski Katedra Fizyki i Biofizyki UWM w Olsztynie."

Podobne prezentacje


Reklamy Google