Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

W celu zbadania mechanizmu działania ITC wykonano następujace badania: Zbadano zmiany aktywności enzymatycznej GST dla zdrowych limfoblastoidów ludzkich.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "W celu zbadania mechanizmu działania ITC wykonano następujace badania: Zbadano zmiany aktywności enzymatycznej GST dla zdrowych limfoblastoidów ludzkich."— Zapis prezentacji:

1 W celu zbadania mechanizmu działania ITC wykonano następujace badania: Zbadano zmiany aktywności enzymatycznej GST dla zdrowych limfoblastoidów ludzkich oraz CCRF-SB z zastosowaniem 1-chloro-2,4- dinitrobenzenu (CDNB) jako substratu ( po inkubacji linii komórkowych z ITC, BSO oraz ich mieszaniną) Jednocześnie zbadano ilość reaktywnych form tlenu metodą cytometrii przepływowej z zastosowaniem dihydrorodaminy (DHR123) jako barwnika Mechanizm regulacji aktywności enzymów, przedstawiony na schemacie, badano przy użyciu mikroskopu konfokalnego z wykorzystaniem przeciwciał skierowanych przeciwko białkom Keap1 i Nfr2 oraz odpowiednich barwników fluorescencyjnych METODYKA BADAŃ Kierownik pracy: prof. dr hab. Teresa Kasprzycka-Guttman, Opiekun pracy: dr inż. Irena Misiewicz-Krzemińska, Narodowy Instytut Leków, Warszawa Joanna Biedrzycka Wprowadzenie Izotiocyjaniany (ITC) są grupą związków biologicznie czynnych występujących głównie w warzywach z rodziny krzyżowych m.in. brokułach, kapuście, brukse- lce, kalafiorze i innych. Zarówno in vivo, jak i in vitro wykazują one silne właściwości chemoprewentywne. Izotiocyjaniany indukują aktywność enzymów 2 fazy metabolizmu w organizmie. Enzymy te chronią komórki przed toksycznymi efektami działania elektrofili i reaktywnych form tlenu (RFT). Jednym z enzymów należących do 2 fazy jest transferaza S-glutationowa (GST). Glutation jest wewnatrzkomórkowym trój- peptydem - -GluCysGly (GSH), który bierze udzia ł w procesach detoksykacji organizmów. Wykazano, że ITC kumulują się w komórkach głównie w postaci ko- niugatów z glutationem, Reakcja ta katalizowana jest przez transferazę S-glutationową. Celem pracy było badanie zmian poziomu glutationu (GSH) i aktywności GST pod wpływem działania trzech ITC: sulforafanu, alyssinu oraz izoticyjanianu 2- oksoheksylu. Badania prowadzono na komórkach o normalnym i obniżonym poziomie glutationu. Czynnikiem obniżajacym poziom GSH jest BSO (butioninosulfoksy- imina), który jest selektywnym inhibitorem syntezy glutationu. Sprawdzano także czy izotiocyjanian 2-oksoheksylu i alyssin działają poprzez ten sam mechanizm molekularny co sulforafan. Sulforafan wpływa na translo- kację białka Nrf2 do jądra komórowego. Tam białko to wiaże się ze składnikami odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE), które są odpowiedzialne za aktywację genów kodujących enzymy 2 fazy. Wnioski Obecność BSO w obu liniach komórkowych po czasie inkubacji 24h powoduje spadek aktywności GST, co wskazuje na niski poziom glutationu (Tabela 1) BSO wpływa na zwiększenie ilości szkodliwych dla organizmu RFT (Rysunek A, B, C, D) Aktywność GST rośnie wraz ze wzrostem stężenia izotiocyjanianów i wydłużaniem czasu inkubacji (Rysunek E, F, G, H) Aktywność GST jest silniej indukowana przez ITC w komórkach ludzkiej białaczki (G, H) Alyssin najsilniej indukuje enzym GST Badania wstępne sugerują, że izotiocyjaniany działają poprzez ten sam mechanizm molekularny co sulforafan ILOŚĆ REAKTYWNYCH FORM TLENU WPŁYW IZOTIOCYJANIANÓW NA AKTYWNOŚĆ GST Czas inkubacji LIMFOBLASTOIDYCCRF-SB KONTROLA+ BSOKONTROLA+ BSO aktywność GST [ mol/ml/min] 24h7,90 ± 0,695,79 ± 0,497,52 ± 0, ± h7,97 ± 0,755,29 ± 0,727,50 ± 0,687,72 ± 0,53 BADANIE DZIAŁANIA IZOTIOCYJANIANÓW NA KOMÓRKI LUDZKIE Izotiocyjanian 2-oksoheksylu CH 3 -CO-(CH 2 )4-NCS 4-metylosulfinylo n-butyl (Sulforafan) CH 3 -SO-(CH 2 ) 4 -NCS 5-metylosulfinylo n-amyl (Alyssin ) CH 3 -SO-(CH 2 ) 5 -NCS Ludzkie komórki białaczki Zdrowe limfoblastoidy ludzkie Induktor - sulforafan Keap 1 – Nrf2 – kompleks pomiędzy białkiem związanym z aktyną Keap1 a czynnikiem transkrypcyjnym Nrf2 ARE – składniki odpowiedzi anty- oksydacyjnej MATERIAŁY DO BADAŃ Zdrowe limfoblastoidy ludzkie Ludzkie komórki białaczki CCRF-SB Próba kontrolna Próba z BSO Próba kontrolna Próba z BSO Wraz ze wzrostem natężenia fluorescencji rośnie ilość RFT A B C D F SFN – Sulforafan SFC – Izotiocyjanian 2-oksoheksylu ALL - Alyssin Zdrowe limfoblastoidy ludzkie Ludzkie komórki białaczki CCRF-SB E G H WPŁYW BSO NA ZMIANY AKTYWNOŚCI ENZYMU GST Tabela 1


Pobierz ppt "W celu zbadania mechanizmu działania ITC wykonano następujace badania: Zbadano zmiany aktywności enzymatycznej GST dla zdrowych limfoblastoidów ludzkich."

Podobne prezentacje


Reklamy Google