Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Wpływ per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny na katalityczną aktywność L -tryptofan indol liazy Praca magisterska wykonana w Pracowni Węglowodanów,

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Wpływ per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny na katalityczną aktywność L -tryptofan indol liazy Praca magisterska wykonana w Pracowni Węglowodanów,"— Zapis prezentacji:

1 Wpływ per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny na katalityczną aktywność L -tryptofan indol liazy Praca magisterska wykonana w Pracowni Węglowodanów, Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski Maciej Rackiewicz Promotor: prof. dr hab. Andrzej Temeriusz Opiekun: mgr Tomasz Gubica Cele pracy: 1. Synteza i oczyszczenie czterech związków: - Heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-α-cyklodekstryna - Heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-α-cyklodekstryna - Heptakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-β-cyklodekstryna - Heptakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-β-cyklodekstryna - Oktakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-γ-cyklodekstryna - Oktakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-γ-cyklodekstryna - Per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryna - Per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryna 2.Zbadanie wpływu jaki wywiera dodatek otrzymanych związków na aktywność enzymu L-tryptofan indol liazy w reakcjach enzymatycznych Wstęp Cyklodekstryny są to cykliczne oligosacharydy zawierające 6, 7 lub 8 jednostek α-1,4- D -glukopiranozowych nazwane odpowiednio α, β i γ- cyklodekstrynami. Cyklodekstryny zostały odkryte i wyizolowane przez Villiersa w 1891 roku w reakcji degradacji skrobi. Cząsteczka cyklodekstryny ma kształt ściętego stożka o otwartych obu końcach gdzie drugorzędowe grupy hydroksylowe przy C-2 i C-3 zorientowane są przy grubszym końcu stożka natomiast pierwszorzędowe grupy hydroksylowe (C-6) przy cieńszym końcu. Wnętrze cząsteczki jest hydrofobowe natomiast powierzchnia zewnętrzna jest hydrofilowa dzięki czemu cyklodekstryny mają zdolność kompleksowania związków organicznych w swojej wnęce. Właściwości te zainspirowały wielu naukowców do badań nad wykorzystaniem tych związków w wielu dziedzinach chemii. Schematy reakcji: Synteza Synteza Zastosowana przeze mnie metoda syntezy została opisana przez Szejti i współpracowników 1. Zastosowana przeze mnie metoda syntezy została opisana przez Szejti i współpracowników 1. 1.Permetylowane α, β i γ-cyklodekstryny Pierwszym krokiem w syntezie było deprotonowanie wszystkich grup wodorotlenowych przy pomocy wodorku sodu (czterokrotny nadmiar w stosunku do ilość grup OH). Następnym krokiem było wprowadzenie odczynnika elektrofilowego jakim jest jodek metylu (siedmiokrotny nadmiar w stosunku do ilości grup OH). Następnie prowadziłem reakcję przez 24 h w temp. pokojowej. Użytym rozpuszczalnikiem był DMF. Surowy produkt oczyściłem przy pomocy chromatografii kolumnowej. Strukturę otrzymanych związków potwierdziłem przez wykonanie widm 1 HNMR, 13 CNMR oraz MS. Pierwszym krokiem w syntezie było deprotonowanie wszystkich grup wodorotlenowych przy pomocy wodorku sodu (czterokrotny nadmiar w stosunku do ilość grup OH). Następnym krokiem było wprowadzenie odczynnika elektrofilowego jakim jest jodek metylu (siedmiokrotny nadmiar w stosunku do ilości grup OH). Następnie prowadziłem reakcję przez 24 h w temp. pokojowej. Użytym rozpuszczalnikiem był DMF. Surowy produkt oczyściłem przy pomocy chromatografii kolumnowej. Strukturę otrzymanych związków potwierdziłem przez wykonanie widm 1 HNMR, 13 CNMR oraz MS. Wydajności reakcji syntezy permetylowanych α, β i γ-cyklodekstryny wyniosła odpowiednio: 81%, 61%, 92%. Wydajności reakcji syntezy permetylowanych α, β i γ-cyklodekstryny wyniosła odpowiednio: 81%, 61%, 92%. 2.Per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryna Syntezę wykonałem metodą opisaną w poprzednich reakcjach. W tym wypadku odczynnikiem elektrofilowym był 1-bromo-2-etoksyetan (BrCH 2 CH 2 OCH 3 ) Zastosowałem siedmiokrotny nadmiar bromku w stosunku do ilości grup wodorotlenowych. Reakcję prowadziłem przez 48 h w temp. 70°C w DMF. Produkt oczyściłem przy użyciu chromatografii kolumnowej. Strukturę otrzymanych związków potwierdziłem przez wykonanie widm 1 HNMR oraz MS. Wydajność wyniosła 86%. Wydajność wyniosła 86%. Badania enzymatyczne: Charakterystyczna zdolność cyklodekstryn do inkludowania wielu związków organicznych wewnątrz hydrofobowej wnęki znalazła zastosowanie w badaniach nad enzymami i reakcjami enzymatycznymi. Prowadzone były badania nad wykorzystaniem pochodnych cyklodekstryn jako imitatorów enzymów 1 oraz jako dodatków do reakcji enzymatycznych 2,3. W swojej pracy zbadałem jaki wpływ wywiera obecność zsyntetyzowanej przeze mnie per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny na aktywność enzymu tryptofanazy katalizującej reakcję hydrolitycznego rozkładu L -tryptofanu do indolu, kwasu pirogronowego oraz amoniaku w obecności fosforanu 5 –pirydoksalu jako kofaktora. Spodziewałem się że pochodna cyklodekstryny będzie inhibitorem reakcji. Inhibicję odwracalną w reakcjach enzymatycznych można podzielić na kompetycyjną i niekompetycyjną. W pierwszym przypadku inhibitor wiąże się z centrum aktywnym enzymu i w ten sposób współzawodniczy z substratem hamując reakcję. W przypadku inhibitora kompetycyjnego możliwe jest także wiązanie się z substratem. Stopień inhibicji w obecności inhibitora kompetycyjnego zależy od stężenia inhibitora i substratu. Inhibicja niekompetycyjna polega na wiązaniu się inhibitora z wolnym enzymem lub z kompleksem enzym- substrat. Inhibitor niekompetycyjny nie wiąże się z enzymem w miejscu aktywnym i dlatego stopień inhibicji nie zależy od stężenia substratu. Zależy on natomiast od stężenia inhibitora. Reakcjeprzeprowadziłem dla trzech różnych stężeń per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny (1, 2 i 3 mM). W każdym przypadku przeprowadziłem 6 reakcji ze zmieniającym się stężeniem substratu ( L -tryptofanu). Przed rozpoczęciem eksperymentu substrat inkubowałem z per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryną przez 24 h.Reakcje prowadziłem w środowisku buforu fosforanowego o pH=8. Przebieg reakcji obserwowałem mierząc absorbancję przy pomocy spektrofotometru UV-VIS co 60 sekund w ciągu 20 minut trwania każdej z reakcji. Reakcje przeprowadziłem dla trzech różnych stężeń per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny (1, 2 i 3 mM). W każdym przypadku przeprowadziłem 6 reakcji ze zmieniającym się stężeniem substratu ( L -tryptofanu). Przed rozpoczęciem eksperymentu substrat inkubowałem z per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryną przez 24 h. Reakcje prowadziłem w środowisku buforu fosforanowego o pH=8. Przebieg reakcji obserwowałem mierząc absorbancję przy pomocy spektrofotometru UV-VIS co 60 sekund w ciągu 20 minut trwania każdej z reakcji. Otrzymane wyniki (zależność szybkości reakcji od stężenia substratu) wykorzystałem do wyznaczenia stałych inhibicji reakcji ( K i ) w równaniu Michaelisa – Mentena. Identyczne pomiary wykonałem dla reakcji z dodatkiem heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-α-cyklodekstryny. Przeprowadziłem również pomiary reakcji enzymatycznych L - tryptofanu bez dodatku pochodnych cyklodekstryn oraz wyznaczyłem parametry K M,. Otrzymane wyniki (zależność szybkości reakcji od stężenia substratu) wykorzystałem do wyznaczenia stałych inhibicji reakcji ( K i ) w równaniu Michaelisa – Mentena. Identyczne pomiary wykonałem dla reakcji z dodatkiem heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-α-cyklodekstryny. Przeprowadziłem również pomiary reakcji enzymatycznych L - tryptofanu bez dodatku pochodnych cyklodekstryn oraz wyznaczyłem parametry K M, V max. Inhibicja kompetycyjna K M = K M (1 + [ I ]/K i ) Inhibicja niekompetycyjna V max = V max / (1+ [ I ]/K i ) Reakcja rozkładu L -tryptofanu do indolu, kwasu pirogronowego i amoniaku katalizowana przez L -tryptofan indol liazę. Literatura: 1. J. Szejtli, A. Liptak, I. Jodál, P. Fugeti, P. Nánási, A. Neszmélyi, Starch – Stärke 32, No. 5, , R. Breslow, S.D. Dong, Chem. Rev. 1998, 98, A. Ghanem, V. Schurig, Tetrahedron: Asymmetry 12, 2001, T. Gubica, E. Boroda, A. Temeriusz, M. Kańska, J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 2006, 54, Wnioski: Z otrzymanych wartości stałych inhibicji wynika, że w przypadku obu związków mamy do czynienia z inhibicją typu mieszanego czyli kompetycyjną oraz niekompetycyjną. Wyniki K 1 i [mM]K 2 i [mM]K M [mM]V max [mM/min] Heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)- α-cyklodekstryna 1,127,31 Per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α- cyklodekstryna 0,243,39 L -tryptofan--3,47x ,77X10 2 K 1 i – stała inhibicji kompetycyjnej K 2 i – stała inhibicji niekompetycyjnej K M – stała Michaelisa V max – prędkość maksymalna reakcji bez inhibitora V max – prędkość maksymalna reakcji z inhibitorem [ I ] – stężenie inhibitora


Pobierz ppt "Wpływ per[2,3,6-tri-O-(2-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny na katalityczną aktywność L -tryptofan indol liazy Praca magisterska wykonana w Pracowni Węglowodanów,"

Podobne prezentacje


Reklamy Google