Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU. Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU. Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy."— Zapis prezentacji:

1 ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU. Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy kwasu fenylopirogronowego znakowanego izotopami wodoru w pozycji trzeciej. Wykorzystałam reakcję oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny katalizowaną przez enzym dehydrogenazę fenyloalaninową (PheDH, Phenylalanine Dehydrogenase, EC ). WSTĘP I ZAŁOŻENIA PRACY Kwas fenylopirogronowy jest metabolitem fenyloalaniny, który pojawia się we krwi u chorych na fenyloketonurię. Fenyloketonuria to genetycznie uwarunkowana choroba metaboliczna. Polega na uszkodzeniu genu kodującego hydroksylazę fenyloalaninową, enzymu, który bierze udział w metaboliźmie fenyloalaniny. Defekt tego enzymu powoduje, że na etapie przekształcania fenyloalaniny w tyrozynę (prekursora hormonów, barwników) pojawia się blokada i fenyloalanina gromadzi się we krwi. Nadmierne jej stężenie, a tym samym jej pochodnych, czyli głównie kwasu fenylopirogronowego, jest przyczyną upośledzenia rozwoju fizycznego i intelektualnego. Rys.1. Schemat przedstawiający metabolizm fenyloalaniny. Praca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów Wydziału Chemii UW Promotor pracy: prof. dr hab. Marianna Kańska Opiekun pracy: mgr Katarzyna Skowera Ilona Ziąbska kwas E-cynamonowy [3(S)-D(T)]-L-fenyloalanina Rys.4. Schemat reakcji addycji amoniaku do kwasu E-cynamonowego. Enzymem katalizującym tę reakcję jest liaza fenyloalaninowa (PAL, Phenylalanine Ammonia Lyase EC ). Jest to enzym powszechnie występujący w roślinach wyższych oraz niektórych gatunkach grzybów. W reakcji addycji amoniaku do kwasu E-cynamonowwego, PAL przyłącza wodór ze środowiska do trzeciego atomu węgla w pozycji pro-S, natomiast wodór w pozycji 3-pro-R pochodzi od kwasu cynamonowego. Rys.5. Model liazy fenyloalaninowej (PAL). SYNTEZA [3(S)-D(T)]-KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO Do syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego wykorzystałam reakcję oksydacyjnej deaminacji znakowanej L-fenyloalaniny. Reakcję tę katalizuje dehydrogenaza fenyloalaninowa (PheDH, Phenylalanine Dehydrogenase EC ). Enzym ten należy do klasy oksyreduktaz. Charakteryzuje się wysoką specyficznością w stosunku do fenyloalaniny, a także do tyrozyny. Katalizuje również reakcję odwrotną. Rys.6. Schemat oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Rys.7. Model dehydrogenazy fenyloalaninowej (PheDH). Kofaktorem dla dehydrogenazy fenyloalaninowej jest utleniona forma NAD +, która podczas reakcji ulega redukcji, dając NADH. NADH wykazuje maksimum absorpcji przy 340 nm, dzięki temu przebieg reakcji można kontrolować spektrofotometrycznie. BADANIA KINETYCZNE Spektrofotometryczna kontrola przebiegu reakcji oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego pozwoliła na wyznaczenie kinetycznych parametrów tej reakcji, czyli szybkości maksymalnej (V max ) oraz stałej Michaelisa (K m ). Porównanie tych wielkości wyznaczonych z przebiegu reakcji w buforze sporządzonym na bazie H 2 O oraz na bazie D 2 O, daje możliwość wyznaczenia rozpuszczalnikowego efektu izotopowego (SIE). Wykonałam serie pomiarów dla obydwu rozpuszczalników, po uśrednieniu wyników wyliczyłam stosunek (k) V max (śr.) do K m (śr.) w H 2 O do V max (śr.) do K m (śr.) w D 2 O. k=1,91 Wynik ten wskazuje jednoznacznie, że rozpuszczalnikowy efekt izotopowy rzeczywiście występuje. H2OH2OH2OH2O D2OD2OD2OD2O V max (śr.) 6,55*10 2 3,92*10 2 K m (śr.) 1,23*10 1 1,41*10 1 Rys.8. Wykres przedstawiający przebieg reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego w H 2 O. Rys.9. Wykres przedstawiający przebieg reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego w D 2 O. Tab.1. Parametry kinetyczne reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Otrzymany kwas fenylopirogronowy redukuje się enzymatycznie do kwasu fenylomlekowego przy udziale dehydrogenazy mleczanowej (LDH, Lactic Dehydrogenase EC ). L-fenyloalaninakwas fenylopirogronowy Rys.2. Reakcja oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Rys.3. Reakcja redukcji kwasu fenylopirogronowego do kwasu fenylomlekowego. kwas fenylopirogronowy kwas fenylomlekowy Mechanizmy reakcji katalizowanych przez dehydrogenazę fenyloalaninową i dehydrogenazę mleczanową nie zostały jeszcze do końca poznane. Ich wyjaśnienie jest możliwe dzięki zastosowaniu metod izotopowych, a w szczególności metody kinetycznych efektów izotopowych (KEI). Aby móc ją zastosować, potrzebne są związki znakowane i dlatego w ramach mojej pracy magisterskiej postanowiłam zająć się ich syntezą. [3(S)-D(T)]-L-fenyloalanina [3(S)-D(T)]-kwas fenylopirogronowy SYNTEZA [3(S)-D(T)]-L-FENYLOALANINY Substratem do syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego była znakowana L-fenyloalanina, którą otrzymałam w wyniku enzymatycznej addycji amoniaku do kwasu E- cynamonowego. Zastosowałam w niej bufor amonowy, wzbogacony wodą deuterowo- trytową, jednocześnie jako źródło amoniaku, izotopów wodoru oraz medium reakcji. BIBLIOGRAFIA 1. W. Hummel, H. Schutte, M.R. Kula, Anal. Biochem., 1988, 170, I. Følling, Acta Pædiatr., 1994, Suppl. 407, W. Hummel, N. Weiss, M.R. Kula, Arch. Microbiol., 1984, 137, Y. Asano, A. Nakazawa, K. Endo, J. Biol. Chem., 1987, 262, J.L. Vanhooke, J.B. Thoden, N.M. Brunhuber, J.S. Blanchard, H.M. Holden, Biochemistry, 1999, 38, , 38, K. Kataoka, K. Tanizawa, T. Fukui, H. Ueno, T. Yoshimura, N. Esaki, K. Soda, J. Biochem, 1994, 116, , 116, K.C. Dooley, Clin. Biochem., 1992, 25, M.A. Vilaseca, C. Ferré, F. Ramón, Clin. Chem., 1993, 39, L.R. Feksa, A.R. Cornelio, C.S. Dutra-Filho, A.T. de Souza Wyse, M. Wajner, C.M. Duval Wannmacher, Brain Research, 2003, 968, Wannmacher, Brain Research, 2003, 968, P.W.K. Wang, M.E. OFlynn, T. Inouye, Clin. Chem., 1964, 10, J. Oberdoerster, M. Guizzetti, L.G. Costa, J. Pharmacol. Experiment. Therapeut., 2000, 295,


Pobierz ppt "ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU. Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy."

Podobne prezentacje


Reklamy Google