Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU. Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU. Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy."— Zapis prezentacji:

1 ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU. Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy kwasu fenylopirogronowego znakowanego izotopami wodoru w pozycji trzeciej. Wykorzystałam reakcję oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny katalizowaną przez enzym dehydrogenazę fenyloalaninową (PheDH, Phenylalanine Dehydrogenase, EC 1.4.1.20). WSTĘP I ZAŁOŻENIA PRACY Kwas fenylopirogronowy jest metabolitem fenyloalaniny, który pojawia się we krwi u chorych na fenyloketonurię. Fenyloketonuria to genetycznie uwarunkowana choroba metaboliczna. Polega na uszkodzeniu genu kodującego hydroksylazę fenyloalaninową, enzymu, który bierze udział w metaboliźmie fenyloalaniny. Defekt tego enzymu powoduje, że na etapie przekształcania fenyloalaniny w tyrozynę (prekursora hormonów, barwników) pojawia się blokada i fenyloalanina gromadzi się we krwi. Nadmierne jej stężenie, a tym samym jej pochodnych, czyli głównie kwasu fenylopirogronowego, jest przyczyną upośledzenia rozwoju fizycznego i intelektualnego. Rys.1. Schemat przedstawiający metabolizm fenyloalaniny. Praca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów Wydziału Chemii UW Promotor pracy: prof. dr hab. Marianna Kańska Opiekun pracy: mgr Katarzyna Skowera Ilona Ziąbska kwas E-cynamonowy [3(S)-D(T)]-L-fenyloalanina Rys.4. Schemat reakcji addycji amoniaku do kwasu E-cynamonowego. Enzymem katalizującym tę reakcję jest liaza fenyloalaninowa (PAL, Phenylalanine Ammonia Lyase EC 4.3.1.5). Jest to enzym powszechnie występujący w roślinach wyższych oraz niektórych gatunkach grzybów. W reakcji addycji amoniaku do kwasu E-cynamonowwego, PAL przyłącza wodór ze środowiska do trzeciego atomu węgla w pozycji pro-S, natomiast wodór w pozycji 3-pro-R pochodzi od kwasu cynamonowego. Rys.5. Model liazy fenyloalaninowej (PAL). SYNTEZA [3(S)-D(T)]-KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO Do syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego wykorzystałam reakcję oksydacyjnej deaminacji znakowanej L-fenyloalaniny. Reakcję tę katalizuje dehydrogenaza fenyloalaninowa (PheDH, Phenylalanine Dehydrogenase EC 1.4.1.20). Enzym ten należy do klasy oksyreduktaz. Charakteryzuje się wysoką specyficznością w stosunku do fenyloalaniny, a także do tyrozyny. Katalizuje również reakcję odwrotną. Rys.6. Schemat oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Rys.7. Model dehydrogenazy fenyloalaninowej (PheDH). Kofaktorem dla dehydrogenazy fenyloalaninowej jest utleniona forma NAD +, która podczas reakcji ulega redukcji, dając NADH. NADH wykazuje maksimum absorpcji przy 340 nm, dzięki temu przebieg reakcji można kontrolować spektrofotometrycznie. BADANIA KINETYCZNE Spektrofotometryczna kontrola przebiegu reakcji oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego pozwoliła na wyznaczenie kinetycznych parametrów tej reakcji, czyli szybkości maksymalnej (V max ) oraz stałej Michaelisa (K m ). Porównanie tych wielkości wyznaczonych z przebiegu reakcji w buforze sporządzonym na bazie H 2 O oraz na bazie D 2 O, daje możliwość wyznaczenia rozpuszczalnikowego efektu izotopowego (SIE). Wykonałam serie pomiarów dla obydwu rozpuszczalników, po uśrednieniu wyników wyliczyłam stosunek (k) V max (śr.) do K m (śr.) w H 2 O do V max (śr.) do K m (śr.) w D 2 O. k=1,91 Wynik ten wskazuje jednoznacznie, że rozpuszczalnikowy efekt izotopowy rzeczywiście występuje. H2OH2OH2OH2O D2OD2OD2OD2O V max (śr.) 6,55*10 2 3,92*10 2 K m (śr.) 1,23*10 1 1,41*10 1 Rys.8. Wykres przedstawiający przebieg reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego w H 2 O. Rys.9. Wykres przedstawiający przebieg reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego w D 2 O. Tab.1. Parametry kinetyczne reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Otrzymany kwas fenylopirogronowy redukuje się enzymatycznie do kwasu fenylomlekowego przy udziale dehydrogenazy mleczanowej (LDH, Lactic Dehydrogenase EC 1.1.1.27). L-fenyloalaninakwas fenylopirogronowy Rys.2. Reakcja oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Rys.3. Reakcja redukcji kwasu fenylopirogronowego do kwasu fenylomlekowego. kwas fenylopirogronowy kwas fenylomlekowy Mechanizmy reakcji katalizowanych przez dehydrogenazę fenyloalaninową i dehydrogenazę mleczanową nie zostały jeszcze do końca poznane. Ich wyjaśnienie jest możliwe dzięki zastosowaniu metod izotopowych, a w szczególności metody kinetycznych efektów izotopowych (KEI). Aby móc ją zastosować, potrzebne są związki znakowane i dlatego w ramach mojej pracy magisterskiej postanowiłam zająć się ich syntezą. [3(S)-D(T)]-L-fenyloalanina [3(S)-D(T)]-kwas fenylopirogronowy SYNTEZA [3(S)-D(T)]-L-FENYLOALANINY Substratem do syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego była znakowana L-fenyloalanina, którą otrzymałam w wyniku enzymatycznej addycji amoniaku do kwasu E- cynamonowego. Zastosowałam w niej bufor amonowy, wzbogacony wodą deuterowo- trytową, jednocześnie jako źródło amoniaku, izotopów wodoru oraz medium reakcji. BIBLIOGRAFIA 1. W. Hummel, H. Schutte, M.R. Kula, Anal. Biochem., 1988, 170, 397-401. 2. I. Følling, Acta Pædiatr., 1994, Suppl. 407, 4-10. 3. W. Hummel, N. Weiss, M.R. Kula, Arch. Microbiol., 1984, 137, 47-52. 4. Y. Asano, A. Nakazawa, K. Endo, J. Biol. Chem., 1987, 262, 10346-10354. 5. J.L. Vanhooke, J.B. Thoden, N.M. Brunhuber, J.S. Blanchard, H.M. Holden, Biochemistry, 1999, 38, 2326-2339. 1999, 38, 2326-2339. 6. K. Kataoka, K. Tanizawa, T. Fukui, H. Ueno, T. Yoshimura, N. Esaki, K. Soda, J. Biochem, 1994, 116, 1370-1376. 1994, 116, 1370-1376. 7. K.C. Dooley, Clin. Biochem., 1992, 25, 271-275. 8. M.A. Vilaseca, C. Ferré, F. Ramón, Clin. Chem., 1993, 39, 129-131. 9. L.R. Feksa, A.R. Cornelio, C.S. Dutra-Filho, A.T. de Souza Wyse, M. Wajner, C.M. Duval Wannmacher, Brain Research, 2003, 968, 199-205. Wannmacher, Brain Research, 2003, 968, 199-205. 10. P.W.K. Wang, M.E. OFlynn, T. Inouye, Clin. Chem., 1964, 10, 1098-1105. 11. J. Oberdoerster, M. Guizzetti, L.G. Costa, J. Pharmacol. Experiment. Therapeut., 2000, 295, 295-301.


Pobierz ppt "ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU. Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy."

Podobne prezentacje


Reklamy Google