Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości."— Zapis prezentacji:

1 Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości

2 Produkcja enzymów

3 Warunki wytwarzania enzymu rekombinowanego 1.Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid kodujący enzym w wektorze z markerem oporności na antybiotyk i obszar induktorowy. Fermentacja okresowa z zasilaniem. Wzrost początkowy w pożywce minimalnej (glukoza + ekstrakt drożdżowy + sole + antybiotyk). W fazie początkowej wzrostu dodawanie składników odżywczych w kontrolowany sposób. Źródło azotu – sole amonowe, mocznik. Po osiągnięciu fazy intensywnego wzrostu – dodanie induktora. Proces trwający 24 – 48 h w temperaturze 24 – 28 C. Osiąga się do 50% ogólnej puli białek, z wydajnością 10 – 15 g/L 2. Alternatywni producenci – drożdże (S. cerevisiae, Pichia pastoris), grzyby – Aspergillus, Fusarium. Gen zintegrowany z chromosomalnym DNA + efektywny promotor. Pożywki z tanimi źródłami węgla i azotu. Fermentacja 4 – 8 dni. Enzymy często wydzielane poza komórkę, co obniża koszty izolacji.

4 Schemat technologiczny wytwarzania enzymu

5 Przykłady enzymów stosowanych w diagnostyce EnzymŹródło (oryginalne)Stosowany do oznaczania Oksydaza cholesterolowa Nocardia erythropolisCholesterol lub Brevibacterium spp. Kreatynaza Pseudomonas spp.Kreatyna Kreatyninaza j.w.Kreatynina -galaktozydaza E. colijony Na +, ELISA Oksydaza glukozowa Aspergillus nigerGlukoza Dehydrogenaza Glc-6-P Leuconostoc mesenteroidesGlukoza -glukozydaza S. cerevisiaeaktywność -amylazy Oksydaza glicerolo-3-P Aerococcus viridiansTriacyloglicerole Heksokinaza S. cerevisiaeGlukoza Peroksydaza ChrzanEnzym wskaźnikowy, testy ELISA Oksydaza pirogronianowa Pediococcus spp.Pirogronian, transami- nazy Oksydaza kwasu moczowego Arthrobacter protopharmiaeKwas moczowy Ureaza Klebsiella aerogenesMocznik

6 Białka rekombinowane terapeutyczne BiałkoLeczona chorobaRok zaakceptowania InsulinaCukrzyca1982 Ludzki hormon wzrostuKarzełkowatość1985 Interferon alfaWirusowe zapalenie wątroby niektóre nowotwory1986 Szczepionka przeciwko wiru- sowemu zap. wątroby typu BZapobieganie WZW typu B1986 Aktywator plazminogenuZawał serca, zator naczyniowy1987 ErytropoetynaAnemia związana z niewydolnoś- cią nerek1989 Interferon gammaChroniczna granulomatoza1990 Czynnik stymulujący granulocyty Neutropenia, stany po przesz- czepach szpiku1991 Czynnik krzepliwości VIIIHemofilia A1992 Interferon betaStwardnienie rozsiane1993 DNazaZwłóknienie torbielowate1994 GlukocerebrozydazaChoroba Gauchera1994 Czynnik krzepliwości IXChoroba Christmasa1997 Interleukina-10Zapobieganie trombocytopenii1997

7 Białka, które są glikoproteinami nie mogą być wytwarzane w komórkach bakteryjnych. Komórki grzybów wytwarzają glikoproteiny o innej budowie niż komórki ssacze.

8 Pierwsze białko terapeutyczne wytwarzane przez zwierzę transgeniczne Atryn, pierwszy lek pochodzący od zmodyfikowanego genetycznie zwierzęcia został dopuszczony do użytku w Europie przez Europejsk ą Agencj ę do spraw Leków (EMEA) w roku Atryn jest uzyskiwany z mleka genetycznie zmodyfikowanych kóz, które mają gen kodujący antyrombinę – białko hamujące patologiczne krzepnięcie krwi. Niedobór antytrombiny – choroba o podłożu genetycznym (1 raz na 5 tys. osób). J edna koza może zastąpić ludzkich dawców krwi.

9 Naturacja białek z ciał inkluzyjnych 1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie w roztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa Problem tworzenia agregatów podczas fałdowania białek

10 Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji Insulina Genentech, Eli Lilly 1.Osobna ekspresja łańcuchów A i B w E. coli jako białek fuzyjnych z syntazą tryptofanową i -galaktozydazą; 2.Rozszczepienie bromocyjanem; 3.Połączenie łańcuchów przez chemiczną reoksydację Novonordisk Ekspresja proinsuliny w E. coli, potem usunięcie enzymatyczne

11 Gensulin (BIOTON) Konstrukcja genu: sekwencja kodującaPeptyd B-dipeptyd-Peptyd A-peptyd nośnikowy Ekspresja w Escherichia coli Produkt: białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnych Etapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacja Półprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymi Obróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem A Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa Dalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazy Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95% Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacja Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9% Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji


Pobierz ppt "Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości."

Podobne prezentacje


Reklamy Google