Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

POWIĄZANIA SZLAKÓW SYGNAŁOWYCH ZALEŻNYCH OD CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH NF  B I p53 W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH PODDANYCH DZIAŁANIU CZYNNIKÓW GENOTOKSYCZNYCH.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "POWIĄZANIA SZLAKÓW SYGNAŁOWYCH ZALEŻNYCH OD CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH NF  B I p53 W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH PODDANYCH DZIAŁANIU CZYNNIKÓW GENOTOKSYCZNYCH."— Zapis prezentacji:

1 POWIĄZANIA SZLAKÓW SYGNAŁOWYCH ZALEŻNYCH OD CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH NF  B I p53 W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH PODDANYCH DZIAŁANIU CZYNNIKÓW GENOTOKSYCZNYCH – wpływ promieniowania na przebieg szlaku NF  B Katarzyna Szołtysek Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów

2 Mechanizm regulacji NF  B, współzależności z p53

3 Cel pracy Identyfikacja funkcjonalnych współzależności między szlakami sygnałowymi zależnymi od czynników transkrypcyjnych NF  B i p53, poprzez m.in. scharakteryzowanie wpływu każdego z tych białek na ekspresję genów regulowanych przez drugi czynnik  Analiza kinetyki aktywacji i przebiegu ścieżki sygnałowej zależnej od NF  B w komórkach stymulowanych promieniowaniem i /lub cytokiną TNF  (analiza Western- blot i EMSA)  Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na ekspresję wybranych genów regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NF  B (analiza QRT- PCR)  Analiza wpływu czasu napromieniowania na ekspresję wybranych genów regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NF  B (analiza QRT-PCR) wpływ promieniowania na przebieg ścieżki NF  B Cel szczegółowy: wpływ promieniowania na przebieg ścieżki NF  B

4 HCT116 ( human colon carcinoma )  p53 +/+ (wt)  p53 -/- ( knock-out ) Model doświadczalny RYC.1. Komórki linii HCT116 (wt). TNF  = 10ng/ml RYC.4. Kinetyka degradacji białka I  B  ( Western-blot) w komórkach linii HCT116 stymulowanych cytokiną TNF  (15-min).  Indukcja ścieżki NF  B - degradacja inhibitora I  B  Charakterystyka modelu doświadczalnego: RYC.2. Transkrypcja genu TP53 ( RT-PCR ) w komórkach linii HCT116 pod wpływem napromienienia UV-C. RYC.3. Akumulacja białka p53 ( Western-blot) w komórkach linii HCT116 pod wpływem napromienienia UV-C lub IR.  Indukcja/akumulacja białka p53 UV = 20J/m 2 IR = 4 Gy

5 K lub Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na aktywację szlaku NF  B i ekspresję wybranych genów zależnych od NF  B Układ doświadczalny: Wykonane analizy:  identyfikacja genów indukowanych przez TNF   identyfikacja genów indukowanych przez TNF  (profil ekspresji – macierz QRT-PCR )  ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów  ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów (QRT-PCR)  analiza kinetyki degradacji inhibitora I  B   analiza kinetyki degradacji inhibitora I  B  (Western-blot)  analiza obecności aktywnego NF  B w jądrze komórkowym  analiza obecności aktywnego NF  B w jądrze komórkowym (EMSA) Wybrane geny: Podjednostki czynnika NF  B: geny NFKB1 i REL Białka regulujące ścieżkę NF  B: geny NFKBIA, BCL3, TNFAIP3 Geny odpowiedzi komórkowej prozapalnej ( TNFA, IL1A, IL8, LTA ) i proprzeżyciowej ( JUN ) TNF  = 10ng/ml UV = 20J/m 2 IR = 4Gy

6 RYC.1. Kinetyka zmian poziomu białka I  B  ( Western-blot) w komórkach poddanych kombinacji stymulacji cytokiną TNF  i promieniowania UV. RYC.2. Detekcja aktywnych form NF  B (test EMSA) w ekstraktach jądrowych z komórek napromieniowanych UV i stymulowanych cytokiną TNF  (wynik testu przeprowadzonego przez dr Natalię Kashchak). Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie hamuje aktywację NF  B i obniża poziom ekspresji genów zależnych od NF  B w komórkach stymulowanych przez TNF  efekt  niezależny od statusu białka p53 Przykładowa analiza przeprowadzona 1h i 6h po stymulacji cytokiną TNF 

7 Analiza wpływu czasu napromieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na ekspresję wybranych genów zależnych od NF  B Układ doświadczalny: TNF  = 10ng/ml UV = 20J/m 2 Wykonane analizy:  ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów zależnych od NF  B  ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów zależnych od NF  B (QRT-PCR)

8 Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresji genów zależnych od NF  B, indukowanych TNF  w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji; efekt  niezależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8 ( QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNF  w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

9 Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresji genów zależnych od NF  B, indukowanych TNF  w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji; efekt  niezależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3 ( QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNF  w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

10 Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresji genów zależnych od NF  B, indukowanych TNF  ; efekt  zależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8 ( QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNF  w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

11 Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresji genów zależnych od NF  B, indukowanych TNF  ; efekt  zależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3 ( QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNF  w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

12 Komórkowa odpowiedź na promieniowanie jest modulowana przez sekwencję czasową aktywacji ścieżek sygnałowych zależnych od czynników NF  B i p53 Napromienienie komórek poprzedzające stymulację cytokiną TNF  Podsumowanie  hamowanie aktywacji ścieżki NF  B i osłabienie ekspresji genów zależnych od NF  B – niezależnie od p53  oscylacje poziomu genów zależnych od NF  B – zależnie od p53


Pobierz ppt "POWIĄZANIA SZLAKÓW SYGNAŁOWYCH ZALEŻNYCH OD CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH NF  B I p53 W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH PODDANYCH DZIAŁANIU CZYNNIKÓW GENOTOKSYCZNYCH."

Podobne prezentacje


Reklamy Google