Oddziaływanie ludzkiej topoizomerazy I z białkami

Prezentacja na temat: "Oddziaływanie ludzkiej topoizomerazy I z białkami"— Zapis prezentacji:

1 Oddziaływanie ludzkiej topoizomerazy I z białkami
Krzysztof Staroń styczeń 2006

2 Problemy topologiczne
dwuniciowego DNA B A

3 Ludzkie topoizomerazy

4 Mechanizm relaksacji DNA przez topoizomerazę I (1)

5 Mechanizm relaksacji DNA przez
topoizomerazę I (2)

6 Kamptotecyna Topotecan (Hycamtin®) Irinotecan(Camptosar®)

7 Struktura ludzkiej topoizomerazy I NT CR LK CT Cap Subdomain III 1 215
434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III Struktura ludzkiej topoizomerazy I

8 Aktywności topoizomerazy I Kinazowa Nacinanie DNA Relaksacyjna ASF/SF2
1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III CPT Relaksacyjna pBR322

9 Substraty aktywności kinazowej
topoizomerazy I Splicing factor SFRS4 (SRp75) Splicing factor SFRS6 (SRp55) Splicing factor SFRS5 (SRp40) Splicing factor ASF/SF2 (SRp30a) Splicing factor SC35 (SRp30b) Splicing factor SFRS9 (SRp30c) P P P P P P P | | | | | | | ...SYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSR...

10 Identyfikacja partnerów białkowych ludzkiej topoizomerazy I

11 Koimmunoprecypitacja
MS analysis SDS-PAGE Koimmunoprecypitacja

12 Poliklonalne przeciwciała
Koimmunoprecypitacja 1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III Poliklonalne przeciwciała anty-topo I

13 Chromatografia powinowactwa MS analysis SDS-PAGE

14 Chromatografia powinowactwa SDS-PAGE NT CR LK CT HeLa nuclear extract
1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III HeLa nuclear extract + - resin GST M.W.

15 Identyfikacja partnerów topoizomerazy I NT CR LK CT Cap Subdomain III
1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III Fibrillarin AAH RNA processing N-acetylotransferase BAB Acetylation B23 nucleophosmin CAA Ribosome biogenesis DNA-PK A Transcription, DNA repair DEAH 68 protein A RNA metabolism H1d NP_ Chromatin structure H1X NP_ Chromatin structure hnRNP A P RNA metabolism hnRNP A2/B NP_ RNA metabolism hnRNP C NP_ RNA metabolism hnRNP R NP_ RNA metabolism hnRNP U S RNA metabolism Hu R NP_ RNA metabolism Ki P Proliferation NDH II Q RNA metabolism Nopp P Nucleologenesis nucleolin NP_ Ribosome biogenesis p AAA Proliferation PARP P DNA repair RH II/Gu AAF RNA metabolism RH p Q RNA metabolism SF2/ASF Q RNA splicing TCOF AAH Ribosome biogenesis Topo II  A Topology control U2snRNP A' NP_ RNA splicing U5snRNP AAB RNA splicing U5snRNP Q RNA splicing U5snRNP NP_ RNA splicing U5snRNP NP_ RNA splicing B23 nucleophosmin CAA Ribosome biogenesis DEAH 68 protein A RNA metabolism H1d NP_ Chromatin structure H1X NP_ Chromatin structure hnRNP A P RNA metabolism hnRNP A2/B NP_ RNA metabolism hnRNP A AAQ RNA metabolism hnRNP C NP_ RNA metabolism hnRNP K P RNA metabolism hnRNP L P RNA metabolism hnRNP R NP_ RNA metabolism hnRNP U S RNA metabolism Hu R NP_ RNA metabolism NDH II Q RNA metabolism nucleolin NP_ Ribosome biogenesis p54nrb Q RNA splicing PARP P DNA repair PSF CAA RNA splicing RH II/Gu AAF RNA metabolism RH p Q RNA metabolism SF2/ASF Q RNA splicing SF3b NP_ RNA splicing SF3b NP_ RNA splicing Topo II  A Topology control

16 Białka oddziałujące z topoizomerazą I
zidentyfikowane we wcześniejszych pracach Znalezione w tej pracy: H1d H1x nucleolin PARP-1 PSF p54nrb SF2/ASF fibrillarin Nieznalezione w tej pracy: ARF CK2 PCNA RNA polymerase II TBP topors WRN p53

17 Wzajemne oddziaływania między białkami
wiążącymi się do topoizomerazy I (baza HPRD) PARP-1 hnRNP A3 nucleolin fibrillarin RHp72 (DDX17) RHp68 (DDX5) RHII/Gu (DDX21) hnRNP U B23 H1d H1x hnRNP A1 hnRNP C hnRNP K hnRNP L hnRNP A2/B1 Hu R hnRNP R PSF DNA-PKcs NDHII (DDX9) Topo IIa SF2/ASF p54nrb U5snRNP 116 U5snRNP 100 U5snRNP 200 U5snRNP 220 SF3B 155 SF3B 130 U2snRNP A’ Ki 67 Nopp 140 TCOF 1 p120 N-acetylotranferase

18 Funkcje białek wiążących się do
topoizomerazy I Splicing and RNA metabolism Ribosome biogenesis and nucleologenesis DNA repair Proliferation Chromatin structure Other

19 215 434 Cap B. Białka wiążące się do rejonu cap

20 rejonu cap i posiadające
215 434 Cap B23 nucleophosmin H1X hnRNP A1 hnRNP A2/B1 hnRNP A3 hnRNP C hnRNP K hnRNP L hnRNP R hnRNP U Hu R NDH II nucleolin PARP-1 p54nrb PSF RH II/Gu RHp68 RH p72 SF2/ASF SF3b130 SF3b155 Topo II  Białka wiążące się do rejonu cap i posiadające tandem domen RRM

21 Domena RRM 215 434 Cap Wiązanie RNA Wiązanie białek UHM

22 215 434 Cap Białko SF2/ASF DGPRSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSYSPRRSRGSPRYSPRHSRSRSRT 1 120 195 248

23 Mapowanie miejsc wiązania białka SF2/ASF na topoizomerazie I
215 434 Cap Mapowanie miejsc wiązania białka SF2/ASF na topoizomerazie I 1 215 636 434 713 765 1 215 434 636 713 765 NT CR LK CT Cap Subdomain III ?

24 Mapowanie miejsc wiązania topoizomerazy I na białku SF2/ASF
215 434 Cap Mapowanie miejsc wiązania topoizomerazy I na białku SF2/ASF 215 434 Cap 1 195 control 248 1 195 120 1 765

25 Dokowanie białek z tandemem RRM na topoizomerazie I
215 434 Cap Dokowanie białek z tandemem RRM na topoizomerazie I p54nrb SF2/ASF

26 Dokowanie SF2/ASF na topoizomerazie I bez DNA i w obecności DNA
215 434 Cap Dokowanie SF2/ASF na topoizomerazie I bez DNA i w obecności DNA - DNA + DNA

27 Konkurencja między tandemem RRM a DNA: wiązanie do cap
215 434 Cap Konkurencja między tandemem RRM a DNA: wiązanie do cap 215 434 GST + DNA

28 Odwracanie nacinania DNA
przez SF2/ASF 215 434 Cap SF2/ASF + camptothecin -

29 Konkurencja między tandemem RRM a DNA: hamowanie nacinania
DNA w obecności kamptotecyny 215 434 Cap control

30 Wzajemne hamowanie aktywności topoizomerazy I przez
substraty obu reakcji 215 434 Cap SF2/ASF + camptothecin - Fosforylacja H Relaksacja DNA CPT

31 Wybór białek do analizy Y2H
215 434 Cap Wybór białek do analizy Y2H hnRNP A1 hnRNP A2/B1 hnRNP A3 hnRNP L Hu R p54nrb PSF SF2/ASF hnRNP R nucleolin

32 PARP-1 hnRNP A3 nucleolin fibrillarin RHp72 (DDX17) RHp68 (DDX5) RHII/Gu (DDX21) hnRNP U B23 H1d H1x hnRNP A1 hnRNP C hnRNP K hnRNP L hnRNP A2/B1 Hu R hnRNP R PSF DNA-PKcs NDHII (DDX9) Topo IIa SF2/ASF p54nrb U5snRNP 116 U5snRNP 100 U5snRNP 200 U5snRNP 220 SF3B 155 SF3B 130 U2snRNP A’ Ki 67 Nopp 140 TCOF 1 p120 N-acetylotranferase Topo I

33 1 215 NT C. Białka wiążące się do domeny N-końcowej

34 Phage display (PhD) 1 215 NT DNA sequencing

35 PhD dla domeny N-końcowej
1 215 NT PhD dla domeny N-końcowej KLWVIPQ KLWVLPK KLWQVFP KVWILTP KVWTIPR KVWYITP KVWDLRS KCCYIPT KGPPITR YVTREPR Ky[WC]xxP DNA-PK

36 Indukcja apoptozy przez DNA-PK
1 215 NT Indukcja apoptozy przez DNA-PK

37 1. Kowalska-Loth, B. , Girstun, A. , Piekiełko A. , Staroń, K. (2002)
1. Kowalska-Loth, B., Girstun, A., Piekiełko A., Staroń, K. (2002). SF2/ASF protein inhibits camptothecin-induced DNA cleavage by human topoisomerase I. Eur. J. Biochem. 269, 2. Trzcińska, A.M., Girstun, A., Kowalska-Loth, B., Staroń, K. (2002) Potential protein partners for the N-terminal domain of human topoisomerase I revealed by phage display. Mol. Biol. Rep. 29, 3. Czubaty, A., Girstu, A., Kowalska-Loth, B., Trzcińska, A.M., Purta, E., Winczura, A., Grajkowski, W., Staroń, K. (2005) Proteomic analysis of complexes formed by human topoisomerase I. Biochim. Biophys. Acta 1749, 4. Kowalska-Loth, B., Girstun, A., Trzcińska, A.M., Piekieko-Witkowska, A., Staroń, K. (2005) SF2/ASF protein binds to the cap region of human topoisomerase I through two RRM domains. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331,

38 Agnieszka Girstun, Alicja Czubaty, Krzysztof Staroń, Agata M
Agnieszka Girstun, Alicja Czubaty, Krzysztof Staroń, Agata M. Trzcińska, Barbara Kowalska-Loth Wojciech Grajkowski, Aleksander Jamsheer, Agnieszka Piekiełko-Witkowska, Elżbieta Purta, Alicja Winczura oraz: