Patogeneza reumatoidalnego zapalenia stawów: rola szpiku kostnego Włodzimierz Maśliński Zakład Patofizjologii i Immunologii Instytut Reumatologii Warszawa

Zdrowy staw RZS Zdegradowana: chrząstka chrząstka kość Zdrowa błona maziowa Spoczynkowe: Błona maziowa w RZS Płyn stawowy RZS Aktywowane: Granulocyty, limfocyty T, limfocyty B, makrofagi komórki NK, płytki krwi Aktywowane: synowiocyty makrofagalne synowiocyty fibroblastyczne, makrofagi, limfocyty T, limfocyty B, komórki: NK, tuczne, plazmatyczne, angiogeneza Synowiocyty makrofagalne Synowiocyty fibroblastyczne Modified from Panayi et al. NEJM, 2001;344:907-16

Obrzęk szpiku i nacieki komórkowe w RZS McQueen FM and Ostendorf B, AR&T 2006, 8:222

Szpik kostny w zwierzęcych modelach zapalenia stawów Podczas wczesnych etapów kolagenowego zapalenia stawów (CIA) (przed objawami zapalenia stawów) obserwuje się powiększenie kanałów łączących szpik ze stawami oraz migrację nimi komórek mezenchymalnych. Terapia anty-TNF blokuje te zjawiska. Marinova-Mutachieva et al. 2002, Arthritis Rheum 46:507 Podczas adjuwantowego zapalenia stawów DNA z mykobakterii jest znajdowane w szpiku i śledzionie, ale nie w stawach. Ronaghy et al. J.Immunol. 2002, 168:51 3. Zapalenie stawów indukowane antygenem może być przeniesione do zdrowych myszy przez przeszczep szpiku, co wskazuje na Kobayashi et al. J. Rheumatol. 2002, 29:1176 4. Efektywna prezentacja antygenu (kilkukrotnie lepsza niż w węzłach chłonnych) zachodzi w szpiku kostym M. Feuerer; Nat Med 2003; 1151-7

Szpik kostny w RZS Udział podchrzęstnego szpiku w RZS Bugatti et al. 2005, Arthritis Rheum 52: 3448 Obrzęk szpiku kostnego w RZS McQueen and Ostendorf. Arthritis Res & Therapy. 2006, 8: 222, Nadżerki kości i obrzęk szpiku kostnego odzwierciedlają prawdziwe zapalenie szpiku w RZS Jimenez-Boj at al. Arthritis and Rheum. 2007, 56: 1118

Zagadnienia Mikrośrodowisko szpiku bogate w cytokiny prozapalne promują dojrzewanie i aktywację osteoklastów Subpopulacje limfocytów w szpiku kostnym: rola IL-15? Komórki regulatorowe w szpiku kostnym Funkcjonalne receptory Toll-podobne (TLR) są obecne na limfocytach B w szpiku kostnym

Elevated levels of TNFa in bone marrow plasma from RA in comparison to OA patients Warnawin et al. in preparation

Elevated levels of IL-1β in bone marrow plasma from RA in comparison to OA patients Warnawin et al. in preparation

Increased levels of IL-15 in RA bone marrow RA BM OA BM IL - 15 ( pg /ml) 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 * 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 RA BM OA BM IL - 7 ( pg /ml) B Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Soluble gp130 blocks IL-6/IL-6R active complex sIL-6R sgp130 gp130 IL-6/sIL-6R/sgp130 - inactivated complex IL-6R signaling

Levels of IL-6, sIL-6R and sgp130 in bone marrow isolated from RA and OA patients IL-6 sIL-6R sgp130 sgp130/IL-6 sgp130/sIL-6R - RA - OA Lower level of sgp130 in RA compensate less IL-6 and sIL-6R than in OA Thus, IL-6/IL-6Ra system forms better microenvironment in bone marrow to activate asteooclasts in RA

RANKL, RANK and OPG regulates maturation, activation and survival of osteoclasts Receptor activator of NF-kB ligand - RANKL Receptor activator of NF-kB – RANK Osteoprotegerin - OPG osteoblasts or bone marrow stromal cells Pro-resorptive hormones, Cytokines , growth factors preosteoclast multinucleated osteoclast activated osteoclast CFU- M Bone osteoblasts or bone marrow stromal cells hormones, cytokines, growth factors apoptotic osteoclast CFU- M Bone Adapted from Boyle WJ, et al. Nature 2003; 423: 337- 42.

Levels of soluble RANKL and OPG in bone marrow plasma OPG/RANKL ratio 28000 200 800 n.s. P < 0.001 P < 0.001 180 700 24000 160 600 20000 140 500 120 16000 OPG concentrations (pg/ml) RANKL concentrations (pg/ml) 100 400 12000 80 300 8000 60 200 40 4000 20 100 OA RA OA RA OA RA Lower OPG/RANKL ratio in RA than in OA suggests that osteoclast maturation/activation microenvironment in RA bone marrow contributes to faster bone degradation Radzikowska et al. in preparation

Wnioski: Podwyższone poziomy cytokin prozapalnych (TNF-a, IL-1 beta, IL-6, IL-15, IL-17) oraz wyższy stosunek RANKL/OPG stwarza w szpiku kostnym mikrośrodowisko promujące zapalenie i degradację kości

Limfocyty T w szpiku kostnym w RZS

Increased absolute T cell number and CD4+/CD8+ ratio in rheumatoid arthritis (RA) bone marrow in comparison to osteoarthritis (OA) B A 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 * 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 14000 14000 14000 14000 p<0.008 p<0.004 12000 12000 12000 12000 * * * * 10000 10000 10000 10000 Number of CD3+ cells/ml of bone marrow 8000 8000 8000 8000 CD3+CD4+ /CD3+CD8+ ratio 6000 6000 6000 6000 4000 4000 4000 4000 2000 2000 2000 2000 RA OA RA OA C 10 20 30 40 50 60 70 80 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 p<0.05 ESR R= - 0.54 Number of CD3+ cells/μl of RA bone marrow Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Increased expression of early activation marker CD69 on RA bone marrow CD4+ and CD8+ T-cells RA BM RA PB OA BM OA PB 0% 5,5% 0,3% CD4 CD69 A 7 7 * * P<0.05 6 6 # # 5 5 P<0.005 4 4 CD3+CD4+CD69+ (%) 3 3 # # 2 2 1 1 - - 1 1 RA BM RA PB OA BM OA PB B 20 20 D RA BM RA PB OA BM OA PB 0% 17,3% 0,3% CD8 CD69 P<0.01 18 18 ^ ^ # # 16 16 P<0.005 14 14 12 12 CD3+CD8+CD69+ (%) 10 10 8 8 # # P<0.005 6 6 4 4 2 2 - - 2 2 RA BM RA PB OA BM OA PB Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Proliferation of bone marrow T cells triggered by IL-15 RA CD3+ CD4+ RA CD3+ CD8+ RA CD3 + CD4 RA CD3 + CD8 + CD3 CD3 + + CD8 CD8 + + Cell number OA CD3+ CD4+ OA CD3+ CD4+ OA CD3 + CD4 + OA CD3 + CD8 + CD3 CD3 + + CD4 CD4 + + CD3 CD3 + + CD8 CD8 + + CFSE Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Formation of germinal centers in early and advanced RA bone marrow Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Czy komórki regulatorowe hamujące odpowiedź immunologiczną są w szpiku kostnym chorych na RZS?

Higher percentage of CD4+Foxp3+ cells in bone marrow of OA than RA patients P<0,05 Massalska et al. In preparation

Limfocyty T w szpiku kostnym chorych na RZS Aktywowane, limfocyty T CD4+, CD8+ są obecne w Wykazuja wyższą ekspresję recptorów dla IL-15 Pod wpływem IL-15 proliferują i wydzielają IL-17 Zwiększone proporcje Th17 i IL-17 Obniżone poziomy FoxP3+, komórek regulatorowych Treg Tworzenie w szpiku kostnym typowych dla węzłów chłonnych centrów rozrodczych z aktywowanymi limfocytami T i B zarówno we wczesnym jak i zaawansowanym RZS

Funkcjonalne receptory Toll-podobne 9 (TLR9) Funkcjonalne receptory Toll-podobne 9 (TLR9) są obecne w limfocytach B pochodzących ze szpiku pacjentów z RZS Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20

Indukcja i podtrzymywanie odpowiedzi immunologicznej: dwa sygnały, kostymulacja, zagrożenie !!! PAMP, DAMP- PRR: TLR,NLR,RLR,RAGE (P. Matzinger 1994, 2004-2007) bakteria Kostymulacja (B7.1, B7.2, /CD28, CD40/CD40L...) Sig.1 Sig.1 B Th Help (sygnał 2) (IL-2, 4, 5....) PPR- pattern recognition receptors TLR- Toll-like receptors NLR- NOD-like receptors RLR- RIG-I-like receptors RAGE- receptor for advanced glycation end-products APC bakteria TLR Cytokiny PAMP Sygnały zagrożenia (Cząsteczki DAMP) zdrowa Ciałka apoptotyczne) komórka uszkodzona PAMP – pathogen associated molecular patterns DAMP – damage associated molecular pattern

RA bone marrow-derived B-cells express TLR9 at mRNA and protein levels Expression of mRNA encoding TLR9 bone marrow 1 2 3 4 peripheral blood TLR9 (260 bp) - RT GAPDH (196 bp) Expression of TLR9 protein + saponin – saponin 0,9 0,9 42,1 2,9 Isotype control TLR9 TLR9 CD19 % of CD19+ cells expressing TLR9 Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20

CpG-ODN, but not GpC-ODN, enhance directly and in a dose-dependent manner, the expression of activation markers (CD86 and CD54) on bone marrow B-cells CD86 Untreated cells Agonistic CpG-ODN 15 mg/ml 30 mg/ml 1,5 2,2 14,8 21,4 Control GpC-ODN 30 mg/ml CD19 Control GpC-ODN Agonistic CpG-ODN, 15 mg/ml Agonistic CpG-ODN, 30 mg/ml CD54 3,9 6,9 25,1 33,8 Agonistic CpG-ODN 15 mg/ml 30 mg/ml BMMC culture Pure B-cells culture Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20

Chloroquine + agonistic CpG-ODN Chloroquine (inhibitor of TLR9 signaling) inhibits CpG-ODN-triggered CD86 and CD54 expression on bone marrow B-cells CD86 CD54 CD19 Agonistic CpG-ODN Chloroquine + agonistic CpG-ODN Untreated cells 4,2 19,3 2,9 2,5 2,7 16,4 Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20

CpG-ODN stimulate proliferation of bone marrow B-cells in BMMC culture (increased Ki-67 expression and diminished CFSE content in CD19+ cells) Ki-67-FITC Ilość komórek n=3 D=0,24 n=4 Agonistic CpG-ODN, 30 mg/ml Agonistic CpG-ODN, 15 mg/ml Control GpC-ODN, 30 mg/ml CFSE CD19-PE ControlGpC-ODN 4,3 20,1 % of CD19+ cells 3,6 Agonistic CpG-ODN Unstimulated control Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20

CpG-ODN induce IL-6 and TNF-a secretion by bone marrow B-cells IL-6 (% of untreated control) ns TNF-a (% of untreated control) ns Untreated Control Agonistic control GpC-ODN CpG-ODN Untreated Control Agonistic control GpC-ODN CpG-ODN 60 hours of the cell culture Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20

Bone marrow CD20+ B-cells express TLR9 CD20low bone marrow peripheral blood B ns p=0.049 TLR9 (% of CD19+ cells) 20 40 80 100 CD20- CD20low CD20+ CD20+ peripheral blood 60 - C TLR9 (Mean Fluorescence Intensity) 64 48 32 16 Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20

Bone marrow CD20+ B-cells respond better to CpG-ODN stimulation than their peripheral blood counterparts BMMC PBMC Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20

Bacterial 16S rRNA / human b-globin DNA ratio Higher frequency of bacterial DNA in bone marrow samples from RA than OA patients Bacterial 16S rRNA / human b-globin DNA ratio p = 0,0079 median within confidence interval 25th-75th percentiles Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20

B-cell maturation in bone marrow Cells Surface antigens Stem cells Pro-B Pre-B Immature B Mature B Activated B Memory B Plasma cell ? TLR 9

Podsumowanie i wnioski (i) Limfocyty B pochodzące ze szpiku pacjentów z RZS wykazują ekspresję funkcjonalnych receptorów TLR9, które uczestniczą w ich aktywacji, produkcji TNF-a i IL-6, proliferacji i różnicowaniu do komórek o fenotypie CD19+CD20+CD27high in vitro (ii) IL-15 zwiększa: indukowany agonistami TLR9 (CpG-ODN) wzrost ekspresji CD86 i CD54, proliferację i promuje dalsze różnicowanie limfocytów B CD19+CD20+CD27high w kierunku komórek plazmatycznych (CD138+CD19lowCD20low) (iii) Podwyższona częstotliwość eubacteryjnego 16S-rybosomalnego RNA in próbkach szpiku od pacjentów z RZS w porównaniu OA wskazuje na rolę bakteryjnych infekcji w patogenezie RZS (iv) Agonistyczne CpG-ODN poprzez TLR9 indukują ekspresje IL-15 i IL-15Ra w jednojądrowych komórkach pochodzących ze szpiku (BMMC) Te dane wskazują na udział ligandów TLR9 i IL-15 w aktywacji szpikowych limfocytów B i sugerują udział w patogenezie RZS

Wnioski Szpik kostny jest wtórnym organem limfatycznym, który aktywnie uczestniczy w inicjacji i podtrzymywaniu chronicznego zapalenia w RZS Przyszłe terapie RZS powinny brać pod uwagę szpik kostny jako jedną z istotnych lokalizacji aktywowanych komórek

Podziękowania Zakład Patofizjologii i Immunologii Klinika Reumoortopedii Tomasz Burakowski Paweł Małdyk Ewa Kontny Cezary Michalak Magdalena Chorąży-Massalska Leszek Jung Anna Radzikowska Jacek Kowalczewski Weronika Rudnicka Ewa Warnawin Zakład Anatomii Patologicznej Maria Ziółkowska Monika Prochorec-Sobieszek