Hodowle tkankowe, komórki macierzyste

Typy hodowli Pierwszorzędowe = pierwotne Wtórne Linie komórkowe Linie unieśmiertelnione telomeraza onkogeny onkowirusy nowotworowe

Pojęcia Medium = pożywka Skład: Zdefiniowane Niezdefiniowane Bezsurowicze Skład: Aminokwasy – 9 egzogennych (His, Ile, Leu, Liz, Met, Phe, Thr, Trp, Val); dodatkowo Cys, Gln, Tyr Witaminy Sole,glukoza Surowica – zawiera insulinę, transferynę Czerwień fenolowa Dodatki: IL-2 dla limfocytów T, erytropoetyna dla erytrocytów

Warunki hodowli Temperatura Tlen, dwutlenek węgla pH Wilgotność powietrza

Laboratorium

Hodowle imitujące warunki fizjologiczne ko-kultury hodowle podtrzymujące z ang. „feeder layers” hodowle 3D na odpowiednich matrycach hodowle uniemożliwiające adhezję

Izolacja komórek rozdrobnienie mechaniczne tkanki Oddzielenie od macierzy międzykomórkowej i rozbicie na pojedyncze komórki rozdrobnienie mechaniczne tkanki trawienie enzymami proteolitycznymi traktowanie EDTA –wiąże jony wapnia potrzebne do kontaktu komórka-komórka Rozbicie komórek szok osmotyczny ultradźwięki przecieranie przez sita homogenizacja

Rozdział frakcji Cytometr przepływowy z sorterem Chemotaksja Adhezja Wirowanie Obecność markerów – antygenów powierzchniowych Tworzenie CFU

Cytofluorymetria przepływowa z sorterem

MACS – rozdział immunomagnetyczny

Schemat izolacji immunomagnetycznej Selekcja pozytywna Selekcja negatywna

Izolacja chemotaktyczna Komórki jednojądrowe ze szpiku kostnego Medium SDF-1 HGF LIF

Wirowanie W gradiencie gęstości: W gradiencie prędkości: frakcje wędrują w zależności od rozmiaru i kształtu gdy użyje się niskiego gradientu cukru (5-20%); w zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu cukru (20-70%) W gradiencie prędkości: frakcje wędrują w zależności od ciężaru – im mniejsza frakcja tym większej prędkości trzeba użyć

Liczenie komórek cytometr Komora Burkera Średnia ze zliczeń Gęstość komórek /cm3: C=n* 105 n- ilość zliczonych komórek

Określenie żywotności Błękit trypanu – martwe-niebieskie jądra Bromek etydyny – martwe-jądra czerwone Jodek propydyny- martwe – jądro czerwone Dwuoctan fluoresceiny – żywe – zielona fluorescencja cytoplazmy

Komórki macierzyste Typy Embrionalne ESC Somatyczne Z krwi pępowinowej

Cechy komórki macierzystej Nieograniczona ilość podziałów Zdolność do różnicowania Zdolność samoodnawiania Świat nauki 05/2002

Podziały Bardzo rzadkie Symetryczne Asymetryczne Regulacja Asymetryczne – po zranieniu trzeba więcej krwi i keratynocytów Symetryczne – regeneracja tkanki sygnały wewnątrzkomórkowe: białka kontrolujące asymetryczne podziały, czynniki transkrypcyjne konkretnych genów, zegary biologiczne odmierzające liczbę podziałów progenitorów, adhezja do macierzy zewnątrzkomórkowej (integryny) Świat nauki 07/1999

Typy komórek macierzystych Totipotencjalne Pluripotencjalne Multipotencjalne Unipotencjalne pluripotencjalne – komórki wewnętrznej masy komórkowej; po 4 dniach tworzy się blastocysta; markery: SSEA3 (stage specific embrionic antigen), TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM-2; ekspresja telomerazy www.wi.mit.edu

Blastocysta Blastocysta = trofoblast + węzeł zarodkowy Trofoblast tworzy łożysko Komórki węzła zarodkowego tworzą 3 listki zarodkowe www.kumc.edu

Blastocysta 0,1 –0,2 mm średnicy 100 –150 komórek www.kumc.edu

Hodowla Komórki węzła zarodkowego Warstwa odżywcza z inaktywowanych fibroblastów mysich Surowica bydlęca inaktywacja przez promienie gamma – nie mogą się dzielić - są tylko podściółką i źródłem czynników wzrostu po usunięciu cytokin i fibroblastów odżywczych tworzą się ciałka zarodkowe – mieszaniny komórek różnych somatycznych macierzystych brak warstwy odżywczej, mimo obecności czynnika wzrostowego (czynnik przeciwbiałaczkowy) – tworzą płaskie rozrosty, zróżnicowane, tracą zdolność do dalszego różnicowania i tworzenia różnych tkanek Świat nauki 06/1999

Różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych MSC Osteoblasty Osteoklasty

zwiększenie aktywności alkalicznej fosfatazy tworzenie ognisk mineralizacji zmiana morfologii i gromadzenie kropli tłuszczu zmiana morfologii i odkładanie proteoglikanów

ESC ZALETY: Pluripotencjalne Zgodność antygenowa – brak odrzutu WADY: Trudna hodowla Nieprzewidywalny kierunek różnicowania Potworniaki 20% Problemy etyczne jeśli pozostaną w zagęszczeniu mimo warstwy odżywczej różnicują w endodermalne (rozpoznawalne dzięki obecności w pożywce alfa fetoproteiny) oraz w trofoblast (obecność gonadotropiny kosmówkowej) dodatkowe cytokiny: LIF, CNF (ciliary neurotrophic factor), onkostatyna M - utrzymują komórki niezróżnicowane

Klonowanie terapeutyczne Jądro komórki somatycznej wprowadzane do pozbawionego jądra oocytu Cytoplazma oocytu „odmładza” jądro Embrion hodowany do stadium blastocysty cytoplazma oocytu potrafi przeprogramować jądro - aktywacja X, wydłużenie telomerów może prowadzić do licznych zaburzeń wzrostu – wadliwa regulacja ekspresji genów www.biochem18.stanford.edu

Problemy Źródło oocytów Nieznana wydajność tej techniki Wydajność 14% - na 1 linię 280 oocytów Oocyty zwierzęce technika pozyskania w klinikach pozwala na zyskanie niewielkiej liczby duże zapotrzebowanie przy zapłodnieniu in vitro oocyty zwierzęce - brak wiedzy na temat interakcji między jądrem a obcą cytoplazmą www.lef.org

Partenogeneza Niezapłodniony oocyt pobudzany do rozwoju Podwójny zestaw chromosomów dawcy oocytu Komórki pluripotencjalne www.bedfordresearch.org

Odróżnicowanie Izolacja enzymów oocytu „odmładzających” jądro Iniekcja do komórki hematopoetycznej Komórki odzyskują pluripotencjalność wyizolować enzymy oocytu odblokowujące DNA z histonów i jego demetylację www.ohsu.edu

Płodowe komórki macierzyste FSC 5-9 tygodniowe płody Izolacja komórek linii płciowej Pierwotne komórki zarodkowe EG kolonie z płodów - ciasno upakowane, wielowarstwowe; z blastocyst – płaskie i luźno upakowane z łożyska – mają aktywność genów Oct4 i nanong, które decydują o możliwości przekształcenia się w każdy rodzaj komórek, brak aktywnej telomerazy, brak możliwości nieograniczonej liczby podziałów; z 1 łożyska można uzyskać 100 mln komórek, które można namnożyć do 10-60 mld bez mysich fibroblastów; brak etycznych ograniczeń; mogą tworzyć inne typy komórek www.molbio.princeton.edu

Migracja ESC do organizmu matki Zaostrzenie chorób autoimmunolo – gicznych Migracja do miejsca uszkodzenia i regeneracja tkanek – ochrona matki poporodowe zapalenie tarczycy z guzkami o komórkach chimerycznych z chromosomami XY Na zdjęciu komórki utworzyły neurony przyspieszenie autoagresji to efekt wcześniejszych uszkodzeń i komórki płodu migrowały do miejsca uszkodzenia Świat nauki 12/2005

Krew pępowinowa Alternatywne źródło krwiotwórczych SC Przeszczepy autogeniczne i allogeniczne Możliwość bankowania 130 tys. porcji zbankowanych 3500 przeszczepów Pierwsza wzmianka o zastosowaniu 1972 rok - bracia Norman i Milton Edge donieśli o skutku podania pacjentce chorej na białaczkę. Pierwsza transplantacja krwi pępowinowej niespokrewnionemu biorcy 1993 rok. Krew była wcześniej zbankowana i zamrożona. www.hemastem.com

Krew pępowinowa ZALETY: WADY: Dostępność i czas Bezpieczna metoda pobrania Większa pula dostępnych dawców Młode SC Mniej nasilone GvH Minimalne ryzyko zakażenia CMV Brak dylematów moralnych WADY: Porcja 100 ml bezpieczna dla biorcy 30 kg Opóźnione zasiedlanie szpiku Ryzyko obciążeń genetycznych Nieznany wpływ bankowania Mniej SC niż w szpiku i krwi mobilizowanej Szybka metoda uzyskania i przygotowania do przeszczepu – do kilku tygodni – dla szpiku co najmniej 4 miesiące (znalezienie dawcy i przygotowanie go do przeszczepu) mają większy potencjał proliferacyjny, dłuższe telomery, zdolność do tworzenia większych kolonii - komórki macierzyste młode – bez efektu starzenia szpikowe starzeją się – liczba i potencjał spada z wiekiem mniej nasilona reakcja GvH (przeszczep przeciw gospodarzowi) po przeszczepie – nawet niezgodność 2 lub więcej antygenów HLA dawała niewielki odsetek GvH; Więcej naiwnych limfocytów T niż szpik co zapobiega ostrej reakcji GvH; Przy przeszczepie allogenicznym niezgodność 1-3 antygenów HLA (spośród 6) jest tolerowana Minimalne ryzyko zakażenia CMV – mniej niż 0,1% zdrowych noworodków zakażonych, dawcy szpiku 10-60% Może być źródłem komórek macierzystych neurogennych, kardiomiogennych, mezenchymatycznych, hepatogennych, prekursorowych dla wysp trzustkowych niewielka ilość uzyskiwana jednorazowo 100ml = miliard komórek, mniejsza niż ze szpiku lub krwi mobilizowanej, użyteczne do przeszczepów u dzieci, bezpieczne dla biorców poniżej 30 kg, próby jednoczesnego podania kilku jednostek Opóźniony efekt zasiedlania szpiku i odbudowy hematopoezy w porównaniuz przeszczepem szpiku wywiad rodzinny dotyczący nowotworów i chorób dziedzicznych, ale ryzyko późnego ujawnienia choroby nie ma dowodów, że przechowywane przez wiele lat będą równie wartościowe jak świeże 5-10% leukocytów mobilizowanej krwi obwodowej, 0,5 –3% szpiku, 0,1- 0,5% krwi pępowinowej

Możliwości zastosowania krwi pępowinowej Leczenie białaczek Leczenie pacjentów po chemioterapii lub radioterapii Uzyskanie komórek nerwowych Uzyskanie komórek mezenchymalnych, trzustkowych i hepatocytów nestyna - marker neurogennych wszczepione myszom zaraz po urodzeniu były zdolne różnicować się w komórki o funkcjach i budowie odpowiedniej dla danego obszaru mózgu; integrowały się z komórkami gospodarza mogą zostać wyposażone w transgeniczny gen naprawiający defekt genetyczny hodowla w obecności NGF i kwasu retinojowego (RA) –wzrost ekspresji markerów gleju i neuronów, spadek ekspresji krwiotwórczych można otrzymać 3 typy: astrocyty, neurony i oligodendrocyty in vitro z prekursorów krwi pępowinowej multipotencjalne - potencjał różnicowania w komórki kości, chrząstki, tkanki tłuszczowej i mięśniowej prekursory włókien mięśniowych produkujących dystrofinę bez cytokin i czynników wzrostu w hodowli zawierała prekursory beta trzustki (produkujące insulinę) oraz hepatocytów CD34, CD133, cKit -migracja do wątroby www.waisman.wisc.edu

Banki krwi pępowinowej PUBLICZNE: Krew sklasyfikowana pod względem HLA Przeszczepy allogeniczne Ponoszą wszystkie koszty Ogólnodostępny rejestr dawców Dowolny biorca KOMERCYJNE: Przeszczepy autogeniczne lub w obrębie rodziny Nie ponosi kosztów Ryzyko zakończenia działalności i zniszczenia komórek koszty pobrania, przebadania i zamrożenia prawdopodobieństwo użycia autologicznego – 1-20 tys. przez pierwsze 20 lat życia do września 2004 roku przeprowadzono 71 przeszczepów z banków prywatnych

Somatyczne komórki macierzyste Niezróżnicowane Ograniczona proliferacja Liczba z wiekiem maleje Efekt starzenia Dostosowanie do niszy tkankowej Nie tworzą potworniaków Stan uśpienia starzeją się – więcej uszkodzeń DNA i mniejsza żywotność podstawowy stan uśpienia w niszach – mała ilość pod wpływem stymulacji środowiska przechodzą fazę przyspieszonych podziałów odpowiedzialne za 1 typ białaczek, niektóre raki żołądka, piersi i mózgu widocznie niezróżnicowane – wyklucza komórki warstwy podstawnej naskórka i przewodów trzustki www.rsna.org

Występowanie somatycznych SC szpik mięśnie – komórki satelitarne skóra jelito wątroba mózg

Wykorzystanie somatycznych SC ZALETY: Brak dylematów etycznych Nie tworzą się potworniaki WADY: Trudność pozyskania Brak zgodności tkankowej Efekt starzenia W stanach chorobowych lub martwicy mniejsza liczba

Przeszczepy Autologiczne Allogeniczne Ksenogeniczne Narządów Tkanek komórek

Możliwości wykorzystania Badania embriogenezy Badania nieprawidłowego rozwoju Badania działania genów Testowanie leków Badanie teratogenów Zastosowania medyczne jak różne typy komórek reagują na dany lek; wpływ leku na różnicowanie komórek, syntetyczne czynniki wzrostu, leki przeciwnowotworowe, można uzyskać np. komórki płuc chorego na mukowiscydozę i badać nowe metody leczenia www.kumc.edu

Ograniczenia Możliwość odrzutu przeszczepu allogenicznego Linie hodowane na mysich fibroblastach i surowicy cielęcej – możliwość transmisji patogenów SC pobierają mysie białko i prezentują je na swojej powierzchni – odrzucenie przeszczepu Trudności uzyskania, hodowli i różnicowania Kontrowersje etyczne linie hodowane na mysich fibroblastach – pobierają mysie białko i prezentują je na swej powierzchni, przełożone do ludzkiej surowicy – zniszczone przez przeciwciała www.zaman.com

Oparzenia Skóra wyhodowana in vitro dostępna komercyjnie Przeszczep odtwarza włosy i gruczoły łojowe Prawidłowy układ strefy wzrostu prawidłowy układ strefy wzrostu, zawierający sprawne komórki macierzyste – nie tracą podczas różnicowania swoich właściwości www.times.hankooki.com

Zawał serca W Polsce 100 tys. rocznie Nekroza kardiomiocytów Blizna łącznotkankowa Przebudowa ściany blizna łącznotkankowa może być etapem wstępnym do tworzenia tętniaka w miejscu blizny i przyległych segmentach miokardium tworzy się ścieniała ściana, dochodzi do niekorzystnej przebudowy mięśnia sercowego przebudowa = umierają kolejne kardiomiocyty, cienieje ściana komory, rozciąga się, pęka zawał: naczynia lewej komory zatkane skrzepem, niedotlenienie, śmierć komórek Świat nauki 12/2004

SSC w terapii pozawałowej -próby przedkliniczne Myszy, szczury, owce, świnie Poprawa kurczliwości Indukcja angiogenezy Prawidłowe ułożenie Ochrona przed dalszą degeneracją Po miesiącu 38% blizny zastąpione tkanką mięśniową po 2 miesiącach na szczurach: naczynia, połączenia, synapsy elektryczne, prawidłowe ułożenie, rozmiar lewej komory, grubość jej ścian i wydolność taka sama jak zaraz po zawale – nie było pogorszenia (a u grupy kontrolnej było) zahamowana niekorzystna przebudowa, wzmocnienie lewej komory serca, wolniejsze poszerzanie jam serca po 9 dniach od przeszczepu komórki adaptowały się do nowego środowiska www.worldhealthspecialists.org

Badania kliniczne Poznań i Paryż Podanie podczas bypassów lub przezskórnie Makrofagi + SC Większość komórek nie przeżywa Zwiększenie frakcji wyrzutowej z 35% do 42% pierwsze przeszczepy mioblasty i komórki satelitarne – w Paryżu i Poznaniu wstrzyknięcie autologicznych mioblastów do blizny podczas pomostowania aortalno – wieńcowego – 10 pacjentów wstrzyknięcie przezskórne – 10 pacjentów podaje się same komórki (łatwe podanie, indukują formowanie macierzy i naczyń, ale niskie przeżycie komórek) albo kawałek tkanki (łatwa hodowla, bardziej stabilne, ale możliwe tylko cienkie fragmenty bo nie jest unaczyniona) uzyskane z biopsji mięśnia czworogłowego uda , gromadzą się na brzegach strefy zawału nie rozwijają się bo nie ma podłoża: kolagen, siarczan heparanu, czynników wzrostu stosowano biopodłoże z alginianu, które samo się rozkładało – ułatwia angiogenezę po 3-6 miesiącach wzrosła frakcja wyrzutowa z 35% przed zabiegiem do 42%, utrzymywała się przez 12 miesięcy www.dir.nhlbi.nih.gov

Cukrzyca typu I SSC trzustkowe Różnicowanie ESC w komórki wysepek trzuskowych Produkcja insuliny Możliwy przeszczep w nie fizjologicznej lokalizacji – pod torebkę nerki 2001 rok – Ronald McCay z mysich ES otrzymał komórki produkujące insulinę, ale w 2003 stwierdzono, że komórki tylko pobrały insulinę z pożywki ekspresja czynnika transkrypcyjnego IPF-1 (insulin promoter factor) biorą udział w tworzeniu gruczolakoraka przewodów trzustkowych www.stemcells.nih.gov

Uszkodzenia wzroku Stosowana terapia SSC z rąbka rogówki In vitro hodowana błonka wszczepiana w miejsce uszkodzenia Oparzenia rogówki www.stemcell.umn.edu

Choroba Parkinsona ok. 300 pacjentów ESC lub SSC Tworzyły połączenia neuronalne, produkcja dopaminy 50% redukcja objawów Efekt utrzymywał się przez 5-10 lat 90-95% komórek zamiera po przeszczepie Na 1 pacjenta potrzeba 6 płodów Zanik neuronów w istocie czarnej Przeszczepione do prążkowia normalizowała poziom jej wydzielania, przywrócenie aktywacji kory, znaczna poprawa funkcji ruchowych Poprawa po 6-24 miesiącach od transplantacji U operowanych jednostronnie efekt był jednostronny efekt szczególnie silny u pacjentów poniżej 60 roku życia u 1 pacjenta poziom dopaminy jest nadal wysoki a przeszczepione komórki żyją po 10 latach nadmiar dopaminy może powodować niekontrolowane ruchy www.stemcells.nih.gov

Udar mózgu oraz uszkodzenia rdzenia kręgowego Podanie dożylne Angiogeneza, neurogeneza, regeneracja funkcjonalna Wydzielają czynniki neuropoezy CD34 znoszą supresję neurogenezy -następuje migracja neuroblastów i neowaskularyzacja Wydzielani endogennych czynników neuropoezy – TGFbeta1, GDNF (neurotropowy czynnik produkowany przez glej), NGF – stymulujące dalsze różnicowanie www.rsna.org

Zęby Badania na myszach SC z miazgi zębów mądrości 15 – 20% miało prawidłowy układ tkanek Ograniczenia: Źródło Rozwój w szczęce dorosłego Tworzenie korzeni Przewidywalna wielkość i kształt muszą się rozwijać w szczęce dorosłych, gdzie nie ma czynników wzrostu dla nich Świat nauki 9/2005

Hodowla narządów Nerka: Wątroba Pęcherz moczowy Autologiczna Na kolagenowym rusztowaniu Po 12 tygodniach produkowała mocz Wątroba Pęcherz moczowy www.obgyn.net

CD34+ 2,5% marker SC CD133+ 1,1% marker SC CD33+ 45% marker komórek hematopoetycznych CD71+ 6% marker limfocytów CD105+ 0,7% marker komórek szpiku CD19+ 24% marker limfocytów B CD14+ 7,8% marker monocytów CD3+ 34% marker limfocytów T