Endogenna transkrypcja zachodzi w 1-komórkowym zarodku myszy

Rozwój embrionalny zazwyczaj zaczyna się okresem cichym transkrypcyjnie, kontrolowanym przez elementy pochodzenia matczynego Okres przejścia z matczynej do embrionalnej kontroli jest różny u różnych gatunków U myszy I transkrypcja była wykryta na poziomie 2 komórek Traktowanie 1-komórkowych zarodków α-amanityną nie upośledzało ich rozwoju aż do późnego 2-komórkowego stadium Synteza ojcowskich białek staje się wykrywalna na poziomie 2-komórek

Przypuszczano, że 1-komórkowe zarodki są transkrypcyjnie nieczynne Cel eksperymentu: Wyznaczenie dokładnego czasu podjęcia aktywności transkrypcyjnej prze zarodek

Materiały i metody Samice myszy C57/CBA były superowulowane (5 UI PMSG i po 48h 5UI hCG) i pokrywane samcami C57/CBA) Zapłodnione oocyty były pobrane 17 h po hCG, oczyszczone i umieszczone w hodowli Cytoplazma zarodków w różnych stadiach była nastrzykiwana 100mM BrUTP Po krótkiej hodowli zarodki były sprawdzane in situ pośrednią metodą immufluorescencyjną

Schemat doświadczenia

Zarodek jest aktywny transkrypcyjnie od stadium 2 komórek Po inkubacji z BrUTP intensywne punktowe oznakowanie obserwowane w jądrach zarodków we wczesnych i późnych stadiach 2- i 4-komórkowych Sygnał reprezentował nowo syntetyzowane RNA Zarodek jest aktywny transkrypcyjnie od stadium 2 komórek BrUTP jest substratem dla RNA polimerazy II

Zarodki z wyznakowanym BrU RNA: 2-kom. /34h po hCG (A, B) i 4-kom Zarodki z wyznakowanym BrU RNA: 2-kom./34h po hCG (A, B) i 4-kom./58h po hCG (C, D)

Nastrzykiwano 1-komórkowe zarodki BrUTP Brak znakowania we wczesnych stadiach zarodka 1-komórkowego Znakowanie BrU późnym zarodku 1-komórkowym Czasami znakowanie w II ciałku komórkowym Brak znakowania przy jednoczesnym nastrzyknięciu α-amanityną i BrUTP Znakowanie znoszone przy zastosowaniu RNazy A Przy zastosowaniu DNazy I wolnej od RNaz znakowanie zachowane Endogenna transkrypcja zachodzi w późnych 1-komórkowych zarodkach

Zarodki 1-komórkowe z wyznakowanym BrU RNA: 22 h po hCG (A, B) i 28 h po hCG (C, D)

Endogenna transkrypcja zachodzi najpierw w męskim przedjądrzu 10% zygot miało wyznakowane jedynie męskie przedjądrze Nie otrzymano jednoznacznego czasu, w którym zachodzi transkrypcja w przedjądrzu męskim (max. częstość zjawiska – ok. 27h po hCG) Duża rozbieżność wyników (25-29h po hCG) spowodowana asynchronią naturalnego zapłodnienia Przedjądrza męskie zarodków z oboma przedjądrzami transkrypcyjnie pozytywnymi były większe niż u zarodków z tylko męskim przedjądrzem pozytywnym Endogenna transkrypcja zachodzi najpierw w męskim przedjądrzu

Zarodek po 27h po hCG z wyznakowanym BrU jedynie przedjądrzem męskim

WNIOSKI Endogenna transkrypcja zależna od polimerazy II zachodzi w póżnym 1-komórkowym zarodku, w późnej fazie S lub G2 Endogenna transkrypcja ma miejsce najpierw w męskim przedjądrzu

KONIEC