Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 1: Wielowymiarowa spektroskopia NMR w badaniach biologicznych

1. ND NMR 2 – 3. Białka 4. Oligonukleotydy 5. Oligosacharydy

Wielowymiarowa spektroskopia NMR w badaniach biologicznych. Oddziaływania pomiędzy spinami jądrowymi. Jądrowy efekt Overhausera (NOE). Czasy korelacji ruchów cząsteczkowych. Ogólny schemat pomiaru NMR w dziedzinie czasu. Detekcja bezpośrednia i pośrednia - widma 2D. Widma wielowymiarowe. Rodzaje widm 2D: widma homojądrowe i heterojądrowe, oddziaływania spin-spin i dipolowe. Różnice pomiędzy widmami COSY i TOCSY. Różnice pomiędzy widmami NOESY i ROESY. Przykład 1: 5'-AMP. Przykład 2: a-cyklodekstryna. Przykład 3: borneol.

Spiny jądrowe mogą oddziaływać ze sobą: przez wiązania chemiczne, przez przestrzeń. Oddziaływania przekazywane przez wiązania chemiczne powodują rozszczepienia sygnałów w widmach NMR i są charakteryzowane przez stałe sprzężenia spinowego - J. Oddziaływania przekazywane przez przestrzeń (oddziaływania dipolowe) wpływają na intensywności i szerokości połówkowe sygnałów w widmach NMR. Ważną cechą oddziaływań dipolowych jest ich zależność od odległości pomiędzy oddziałującymi spinami ~r -6.

Przykłady Protony H1 i H2 oddziałują przez 3 wiązania (3JHH  8 Hz) oraz przez przestrzeń (r  2,5 Å). Protony H1 i H4 oddziałują przez 5 wiązań (5JHH  0,5 Hz), ale nie oddziałują przez przestrzeń (r  5 Å). Protony grupy metylowej H9 i protony pierścieniowe H5 i H6 nie są sprzężone (5JHH = 0 Hz), ale oddziałują przez przestrzeń (2,1 < r < 4 Å).

Jak można wykryć oddziaływania dipolowe ? Jądrowy efekt Overhausera (NOE). Zmiana natężenia sygnału spinu jądrowego A na skutek zakłócenia stanu równowagi termodynamicznej z otoczeniem spinu jądrowego X. Taka zmiana pojawia się jedynie wtedy, gdy spiny A i X oddziałują dipolowo. NOE jest opisywany ilościowo przez współczynnik wzmocnienia h = (Izakł - I0)/I0. A i X są protonami homojądrowy NOE A lub X heterojądro heterojądrowy NOE

Czas korelacji dla ruchu cząsteczkowego - tc. Dla dyfuzji rotacyjnej sztywnej cząsteczki tc oznacza czas potrzebny do zmiany orientacji cząsteczki o 1 radian. Czasy korelacji definiują jedną ze skal czasów NMR. graniczne dyfuzja zwężenie obszar przejściowy spinowa Relacja pomiędzy wL i tc definiuje podział na: obszar granicznego zwężenia, obszar przejściowy, obszar dyfuzji spinowej. Homojądrowy NOE h = 0 dla wLtc = 1,12

Homojądrowy efekt Overhausera w laboratoryjnym układzie współrzędnych - NOE, wirującym układzie współrzędnych - ROE. NOE zmienia znak ROE zawsze dodatni

Heterojądrowy NOE

Schemat czasowy pomiaru NOE Selektywne napromieniowanie sygnału spinów X powoduje zakłócenie ich stanu równowagi. Oddziaływanie dipolowe transmituje to zakłócenie do spinów A. Sygnał spinów A zmienia intensywność. Współczynnik wzmocnienia NOE: hA{X}

Przykład Rozróżnienie izomerów: kwas cytrakonowy kwas mezakonowy. widma różnicowe kwas mezakonowy (słaby NOE) kwas cytrakonowy (silny NOE)

Najprostszy schemat pomiaru widma NMR. Ten schemat można w ogólny sposób podzielić na dwa etapy. przygotowanie detekcja Przygotowanie - wytworzenie nierównowagowego stanu układu spinowego. Detekcja - rejestracja sygnału swobodnej precesji (FID) podczas powrotu układu spinowego do stanu równowagowego. Taki sygnał zawiera informacje o położeniach, kształtach i intensywnościach sygnałów. Sygnał FID jest funkcją czasu ta i dopiero operacja FT przetwarza go na funkcję częstości.

Ten ogólny schemat można rozszerzyć. Pomiar NOE Bardziej złożony etap przygotowania. przygotowanie rejestracja Ten ogólny schemat można rozszerzyć.

Pomiar ROE Pomiędzy etapami przygotowania i rejestracji przygotowanie mieszanie rejestracja Pomiędzy etapami przygotowania i rejestracji można umieścić etap mieszania. Mieszanie - zmiana stanów różnych spinów jądrowych na skutek oddziaływań spinowych lub dipolowych.

Do tego momentu omawialiśmy widma NMR, w których częstości rezonansowe jąder były rejestrowane bezpośrednio. Jednak po etapie przygotowania spiny jądrowe będą wykonywały precesję z charakterystycznymi dla siebie częstościami niezależnie od tego czy będziemy rejestrować sygnał FID czy też nie. Rozszerzenie schematu: przygotowanie (td) - mieszanie (tm) - rejestracja (ta) na: przygotowanie (td) - ewolucja (t1) - mieszanie (tm) - rejestracja (t2) stwarza nową jakość w spektroskopii - widma dwuwymiarowe (2D). Podczas ewolucji (podobnie jak podczas rejestracji) spiny precesują ze swoimi charakterystycznymi częstościami.

Wielokrotne wykonanie pomiaru, w którym jedyna zmiana polega na zwiększaniu w stały sposób czasu ewolucji powoduje, że na początku czasu mieszania w każdym z pomiarów układ spinów znajduje się w innym stanie, co powoduje zmiany faz i intensywności sygnałów. W tych zmianach zakodowana jest informacja o częstościach spinów. t1=t0+3Dt t1=t0+2Dt t1=t0+Dt t1=t0 Odpowiednie sekwencje pomiarowe pozwalają wybrać podczas etapu mieszania przekazywanie korelacji przez oddziaływania spinowe lub dipolowe.

Koncepcję pomiaru widm 2D można dalej rozszerzyć na widma 3D czy 4D. 1D: (td) - (ta) 2D: (td) - [(t1) - (tm)] - (t2) 3D: (td) - [(t1) - (tm1)] - [(t2) - (tm2)] - (t3) 4D: (td) - [(t1) - (tm1)] - [(t2) - (tm2)] - [(t3) - (tm3)] - (t4) 32·2s=64s 512·16·2s4,5h 64·128·4·2s18h 32·32·64·2·2s3d Zwiększanie liczby wymiarów ma swoją cenę, ogromne wydłużenie czasu pomiaru i pogorszenie rozdzielczości w widmie.

częstości tego samego izotopu na obu osiach. Widma homojądrowe: częstości tego samego izotopu na obu osiach. Sygnały diagonalne (f1 = f2) i sygnały korelacyjne (f1  f2). Widma heterojądrowe częstości różnych izotopów na osiach. Tylko sygnały korelacyjne. Detekcja protonowa charakteryzuje się znacznie lepszą czułością niż detekcja heterojądrowa. HSQC lepsze niż HETCOR

Homojądrowe widma 2D: COSY - korelacje przez homojądrowe sprzężenia spinowe, TOCSY - korelacje przez homojądrowe sprzężenia spinowe w całym układzie spinowym, NOESY - korelacje przez oddziaływania dipolowe w laboratoryjnym układzie współrzędnych, EXSY - korelacje przez powolną wymianę chemiczną ROESY - korelacje przez oddziaływania dipolowe w wirującym układzie współrzędnych. Heterojądrowe widma 2D: HSQC - korelacje przez heterojądrowe sprzężenia spinowe przez 1 wiązanie, HMBC - korelacje przez heterojądrowe sprzężenia spinowe dalekiego zasięgu (przez więcej niż 1 wiązanie).

Różnica pomiędzy COSY i TOCSY Schematyczne położenie sygnałów w widmach COSY i TOCSY układu spinowego kwasu N-acetyloglutaminowego: CH3CONHCH(COOH)CH2CH2COOH. TOCSY dobrze sprawdza się w układach liniowych, ale w układach cyklicznych widma COSY dostarczają bardziej jednoznacznych informacji.

Struktura subtelna sygnałów korelacyjnych w widmach COSY Struktura sygnału korelacyjnego HA/HB w czterospinowym układzie ABCD, w którym proton HA jest sprzężony z pozostałymi protonami. JAB - aktywna stała sprzężenia, JAC, JAD - pasywne stałe sprzężenia. Struktura sygnału korelacyjnego HA/HB w czterospinowym układzie ABCD, w którym proton HA jest sprzężony z pozostałymi protonami. JAB - aktywna stała sprzężenia, JAC, JAD - pasywne stałe sprzężenia. Struktura sygnału korelacyjnego HA/HB w czterospinowym układzie ABCD, w którym proton HA jest sprzężony z pozostałymi protonami. JAB - aktywna stała sprzężenia, JAC, JAD - pasywne stałe sprzężenia. Aktywna (w antyfazie) i pasywna (w fazie) stała sprzężenia spinowego. Aktywna (w antyfazie) i pasywna (w fazie) stała sprzężenia spinowego.

Mała wartość aktywnej stałej sprzężenia osłabia intensywność sygnału korelacyjnego w widmie COSY. Mała wartość aktywnej stałej sprzężenia osłabia intensywność sygnału korelacyjnego w widmie COSY. Mała wartość aktywnej stałej sprzężenia osłabia intensywność sygnału korelacyjnego w widmie COSY. W widmach TOCSY składowe sygnałów korelacyjnych mają zgodne fazy i dlatego niezależnie od wielkości aktywnej stałej sprzężenia nie ulegają osłabieniu. W widmach TOCSY składowe sygnałów korelacyjnych mają zgodne fazy i dlatego niezależnie od wielkości aktywnej stałej sprzężenia nie ulegają osłabieniu.

Widma NOESY, ROESY i EXSY Relacja faz sygnałów diagonalnych i korelacyjnych Laboratoryjny układ współrzędnych (NOESY/EXSY) obszar granicznego zwężenia: oddz. dipolowe - przeciwna wymiana chem. - zgodna obszar dyfuzji spinowej: oddz. dipolowe - zgodna Wirujący układ współrzędnych (ROESY) niezależnie od czasu korelacji: oddz. dipolowe - przeciwna

Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR 5'-AMP 5'-monofosforan adenozyny Przykład 1. HDO H8 H2 H1' Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR

5'-AMP Widmo 2D COSY H5'5'' H4' H3' H2' H1'

5'-AMP 2D 1H/13C HSQC H3' H4' H8 H2 H1' H2' H5’5’’

a-cyklodekstryna Przykład 2. cykliczny związek zbudowany z 6 glukoz Związek ma oś symetrii C6, więc odpowiednie protony we wszystkich glukozach są homotopowe i dlatego mają tę samą wartość przesunięcia chemicznego, np. 6 protonów H1 czy 6 protonów H2.

Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR a-cyklodekstryna Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR H1 HDO

H4/H5 H3/H4 a-cyklodekstryna H1/H2 H2/H3 H1 Widmo 2D COSY

Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR a-cyklodekstryna Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR H6,6' H1 H4 H2 H3 H5 HDO

Jednowymiarowe (1D) widmo 13C NMR a-cyklodekstryna Jednowymiarowe (1D) widmo 13C NMR Intensywności w widmie są zakłócone ! C1 C6

H6,6' H1 H2 H4 H3 H5 C6 C5 C2 C3 C4 2D 1H/13C HSQC C1

a-cyklodekstryna C5 C2 C4 C1 C6 C3

Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR Przykład 3. borneol bicykliczny monoterpen Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR aceton 3 x Me Zaznaczone przypisania otrzymano z analizy widma COSY, w którym jednak brak korelacji do grup metylowych. 5X, 6N 4 5N 3N 2 6X 3X

Przesłanką do identyfikacji grupy Me10 mogą być intensywności sygnałów metylowych. Małe (4J<0,5 Hz) sprzężenia spinowe przez 4 wiązania. Me8: 3·H9+H4 - 4 protony, Me9: 3·H8+H4 - 4 protony, Me10: H2+2·H6 - 3 protony, większa intensywność. A B C borneol Me10 ? 3N

borneol widmo 2D NOESY 5N/5X 6X/6N

widmo 2D NOESY - rozciągnięcie borneol widmo 2D NOESY - rozciągnięcie 2 3X 5X 4 6X Oczekiwane korelacje 2: Me8, Me10 3X: Me8, 3N 5X: Me9 4: Me8, Me9, 3N 6X: Me9, Me10 Korelacje widoczne 2: A, B, C 3X: A, B, 3N 5X: A 4: A, B, 3N 6X: A, B, C Wnioski: 5X/A: A=Me9 4/(A,B,3N) oraz 3X/(A,B,3N): B=Me8 korelacje do 2 i 6X potwierdzają, że C=Me10