Spektroskopowe metody identyfikacji związków Spektroskopia NMR – techniki dwuwymiarowe Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI)

Widmo kamfory wykonane przy różnej rozdzielczości spektrometru

Eksperymenty jednowymiarowej spektroskopii NMR – badanie wiązań wodorowych NHGly(1) / NHΔAla(5) / NHGly(4) / NHΔAla(2) \ - NHGly(3) / NHGly(6) Wpływ temperatury na wartość przesunięcia chemicznego protonów amidowych dla peptydu Boc–Gly-ΔAla-Gly–Gly-ΔAla-Gly-OMe

Widmo 1H NMR aktyny – białka zbudowanego z 375 reszt aminokwasowych

W przypadku większych układów i makromolekuł widma jednowymiarowe nie dostarczają dostatecznych informacji – konieczne staje się zastosowanie technik dwuwymiarowych. Generalnie widma tego typu bazują na dwóch typach oddziaływań: - sprzężenie skalarne – przez wiązanie – badanie struktury, - sprzężenie dipolowe – przez przestrzeń – badania konformacyjne.

Problem przypisania sygnałów na widmie peptydu/białka H3C CH3 Sprzężenie skalarne – poprze wiązania (J-couplings) Oddziaływanie przez przestrzeń - dipolowe (NOE) H C O H N C C N H H

Wielowymiarowy NMR 2D 3D 1D MW ~ 300 MW ~ 10000 MW ~ 30000

Schemat eksperymentu jednowymiarowego:

Eksperyment dwuwymiarowy

W rezultacie otrzymujemy:

Najpopularniejsze eksperymenty dwuwymiarowe Rodzaj badanych oddziaływań zastosowanie COSY COrrelated SpectroscoPY Homo lub heterojądrowe sprzężenie spin-spin Analiza sprzężonych ze sobą atomów DQF COSY Double Quantum Filtered COSY Homojądrowe sprzężenie spin-spin Analiza sprzężonych ze sobą atomów, Pomiar stałych sprzężenia TOCSY TOtal Correlation SpectroscopY Korelowanie ze sobą całych układów spinowych

Heteronuclear Multiple Quantum coherence HMQC Heteronuclear Multiple Quantum coherence Heterojądrowe sprzężenia spin-spin Korelacja przesunięć chemicznych protonów i heteroatomòw związanych przez jedno wiązanie HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Korelacja przesunięć chemicznych protonów i heteroatomòw związanych przez kilka wiązań COSY-LR Longrange Correlated SpectroscopY Analiza sprzężeń dalekiego zasięgu

Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY Homojądrowe oddziaływania dipolowe Wyznaczanie odległości pomiędzy atomami ROESY Rotating Frame NOESY Wyznaczanie odległości pomiędzy atomami, stosowane w badaniach makromolekul

W badaniach strukturalnych największe znaczenie mają eksperymenty bazujące na sprzężeniach skalarnych – poprzez wiązania. Na podstawie analizy otrzymanych w ten sposób rezultatów możliwe jest przypisanie sygnałòw na widmie a co za tym idzie określenie struktury. A oto kilka przykładów

Widmo HHCOSY β-butyrolaktonu

Widmo HHCOSY kodeiny H-5 —> H-3 —> H-10 —> OH H-10 -> H-9 H-3 —> H-16 H-16 —> H-11

Spektroskopia 13C NMR Metoda ta rozwinęła się stosunkowo niedawno – podstawowe przeszkody we wcześniejszym wykorzystaniu tej techniki stanowiły: - natruralna abundancja izotopu 13C wynosi zaledwie 1.1%, - czterokrotnie mniejsze odstępy poziomów spinowych (w porównaniu do 1H), co w rezultacie daje znacznie mniejszą intensywność sygnałów

Pełne wykorzystanie faktu zjawiska węglowego rezonansu jądrowego umożliwiły: - ulepszenie metodyki i aparatury – wprowadzenie rejestracji widm metodą impulsową z transformacją Fouriera, - wykonywanie widm z rozprzęganiem jąder 13C - brak multipletowości na widmie powoduje zwiekszęnie intensywności sygnałów. W przypadku spektroskopii podstawowym kryterium analizy widm jest przesunięcie chemiczne.

Zakresy przesunięć chemicznych na widmach 13C NMR

Widmo 1H i 13C NMR β-butyrolaktonu

Widmo CHCOSY β-butyrolaktonu

Widmo CHCOSY modyfikowanego glutationu

Widmo HH COSY

HMQC – Heteronuclear Multiple Quantum Coherence Korelacja przesunięć chemicznych protonów związanych z jądrem X przez jedno wiązanie

HMBC – Heteronuclear Multiple Bond Correlation Korelacja przesunięć chemicznych protonów związanych z X przez kilka wiązań

HMQC – Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HMBC – Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Widmo HHCOSY i TOCSY reszty aminokwasowej:

2002 – nagroda Nobla z dziedziny chemii - Kurt Wüthrich – pokazał, że strukturę białek można badać za pomocą NMR

Widmo NMR białka

NOESY TOCSY

Widmo NOESY białka

Oddziaływania obserwowane na widmie NOESY

Spektroskopia NMR Przypisanie sygnałów Intensywność Sygnałów NOE Sprzężenia obliczenia dynamiki molekularnej

Magnetic Resonance Imaging – MRI – obrazowanie rezonansem magnetycznym

Na czym polega obrazowanie rezonansem magnetycznym? Obrazowana jest każda warstwa podzielona na komórki “voxels”

We wnętrzu każdej „komórki” jest woda. Jądra 1H w cząsteczkach H2O działają jak małe magnesy

Pod wplywem impulsu elektromagnetycznego o częstości radiowej można zmienić orientację spinów jądrowych N N Kiedy spiny jądrowe powracają do położenia równowagi to jest emitowane promieniowanie radiowe

fast Spiny jądrowe w różnych tkankach powracają do stanu równowagi w różnym czasie. Aby rozróżnić sygnały pochopdzące z różnych tkanek zastosowano pole magnetyczne z gradientem. slow

B0 B1

Obrazowanie bezkontrastowe

Przykładowe związki stosowane jako kontrast w MRI

Obrazowanie jamy brzusznej przy zastosowaniu kontrastu Obrazowanie serca z zastosowaniem kontrastu

Obrazowanie kolana Protony pochodzenia tłuszczowego Protony pochodzące z wody