Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 3: Badania strukturalne oligonukleotydów

Budowa kwasów nukleinowych – schemat ogólny zasada azotowa zasada azotowa zasada azotowa 5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3' 5' koniec 3' koniec

Budowa kwasów nukleinowych część cukrowa – struktury zasada 2'-deoksyryboza ryboza

Budowa kwasów nukleinowych część cukrowa – przesunięcia chemiczne 1H [ppm] DNA RNA G A C T G A C U H1' 5.8 5.8 5.5 6.0 5.6 6.0 5.6 5.6 H2' 2.6 2.6 2.0 2.1 4.6 4.7 4.5 4.3 H2'' 2.7 2.8 2.3 2.6 - - - - H3' 4.9 5.0 4.8 4.9 4.5 4.7 4.5 4.6 H4' 4.4 4.4 4.1 4.2 4.4 4.5 4.4 4.3 H5' 4.0 4.2 4.1 - 4.3 4.5 4.4 4.3 H5'' 4.1 4.2 4.3 - 4.1 4.2 4.0 4.0 13C [ppm] DNA RNA C1' 86 87-92 C2' 40 74-76 C3' 80 70-75 C4' 88 80-84 C5' 65 63-69

Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – struktury A, G – puryny C, T(U) - pirymidyny tymina cytozyna uracyl guanina adenina

Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 1H zasada niewymienialne wymienialne T H(6) 6.9-7.9 NH (3) 13-14 CH3(5) 1.0-1.9 U H(5) 5.0-6.0 NH(3) 13-14 H(6) 6.9-7.9 C H(5) 5.0-6.0 NH2(4) 6.7-7.0 / 8.1-8.8 H(6) 6.9-7.9   A H(2) 7.5-8 NH2(6) 5-6 / 7-8  H(8) 7.7-8.5 G H(2) 7.5-8.0 NH(1) 12-13.6 H(8) 7.5-8.3 NH2(2) 5-6 / 8-9

Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 13C i 15N DNA RNA G A C T G A C U N1 160 213 151 142 146 222 151 142 C2 157 155 159 154 157 151 158 154 N3 146 222 196 160 160 213 196 160 C4 162 158 168 170 153 150 169 169 C5 117 120 99 114 117 120 95 100 C6 154 150 143 140 162 157 138 139 N7 233 230 233 230 C8 138 142 135 138 N9 170 170 168 169 NH2 75 81 98

Budowa kwasów nukleinowych sprzężenia spinowe cukier 1J(C1’H1’) 170-180 1J( C2’H2’) 155-160 1J( C3’H3’) 140-150 1J( C4’H4’) 145-155 1J( C5’H5’) 145-150 1J( C5’H5’’) 145-150 zasada azotowa imina 1J(NH) 90 1J(CH) 180-225 1J(C8N9) 4-8 1J(C8N7) 10 1J(C6N1) 13 cukier – zasada 1J(C1’N1) 11-13 1J(C1’N9) 11-13

Komplet sprzężeń 1J w guaninie calc GTP exp C8-H8 210.0 216.3 N2-H2 -93.3 -91.7 -90.1 C4-C5 57.6 63.5 C4-N9 -19.8 -19.2 C5-C6 96.6 87.9 C5-N7 6.8 4.1 C6-N1 -2.0 -5.9 C8-N9 nakład C8-N7 -8.7 K. Ruszczyńska et al., Biophysical Journal, 85, 1450 (2003).

Struktura drugorzędowa kwasów nukleinowych http://rmn.iqfr.csic.es/guide/eNMR/adn/watson.html

Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych dwuniciowe helisy B Z B: typowa dla dwuniciowego DNA w komórkach A: dwuniciowy RNA i DNA+RNA Z: obszary DNA posiadające naprzemiennie puryny i pirymidyny; np. 5'-CGCGATCG-3'

Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych trypleksy tetrapleksy

Motywy drugorzędowe struktury RNA Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych Motywy drugorzędowe struktury RNA Rodzaje RNA rybosomalny (rRNA) matrycowy (mRNA) transportujący (tRNA) niekodujący (ncRNA) Struktury RNA

Przypomnienie Ogólna strategia wyznaczania struktur białek 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego białka lub kompleksu białkowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

Ogólna strategia wyznaczania struktur kwasów nukleinowych 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego kwasu nukleinowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

RNA - 34 nt; typowe widmo 1H NMR H2',H3',H4',H5',H5'' H2,H6,H8,NH2 H5,H1' NH

DNA - 20 nt; typowe widmo 1H NMR różnice względem RNA: H2',H2'' oddzielone; CH3(T)

Przypisanie sygnałów: RNA - korelacje H1'/H2'

Przypisanie sygnałów: RNA – korelacje H1'/C1' 20-nt RNA, naturalna zawartość 13C, 30 oC

Przypisanie sygnałów: RNA –korelacje H2'/C2'…H5'H5''/C5'

Przypisanie sygnałów: DNA – korelacje H2/H7 w tyminach

Przypisanie sygnałów: korelacje H5/H6 w cytozynach i uracylach

Przypisanie sygnałów: korelacje C5/H5 w cytozynach i uracylach

Przypisania sekwencyjne: korelacje 1H/31P

800 MHz, m=300ms, 100% 2H2O, 25°C H1' / H5 (ppm) Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H5/H1' A A G A 15 2D NOESY C G G1 U A 20 G C G C A 10 A U U U 25 G C C33 H2 / H6 / H8 (ppm) A U U G G C 5 2.45 Å C26 H5-H6 G C 30 A U G C G C 5’ 3’ 800 MHz, m=300ms, 100% 2H2O, 25°C H1' / H5 (ppm)

Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H6,H8/H1' 20 nt RNA, NOESY

Przypisania sekwencyjne: DNA – korelacje H6,H8/H1' 27 nt DNA, NOESY

Inne możliwe przypisania sekwencyjne: DNA i RNA H6,H8/H2' H6,H8/H2' H6,H8/H2'' 2H6,H8/H3' H6,H8/H4'

Przypisania sekwencyjne: korelacje protonów iminowych (tylko G i T/U) U20G21 G19 A22 G18 – C23 G17 – C24 C16 – G25 A15 – U26 U13 C14 – G27 C12 C11 U10 U9 A8 C7 – G28 A6 – U29 G5 – C30 G4 – C31 A3 – U32 G2 – C33 G1 – C34

Przypisania w oligonukleotydach znakowanych cukry 3D HCCH-COSY 3D HCCH-TOCSY zasady 3D HbCbNb H6-C6-N1 H8-C8-N9

Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada 3D HCN lub 2D H(C)N H1'-C1' -N1/N9

Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada 2D H(C)N

1hJNH Więzy wiązań wodorowych – parowanie zasad 2JNN 2D H(N)N-COSY 2 – 4 Hz 6 – 7 Hz 2JNN 2D H(N)N-COSY

Parowanie zasad 10 2D HNN-COSY 2D NOESY N1 N3 15N (ppm) N3 1H (ppm) N1 800 MhHz, 95% H2O, 5°C 1H (ppm) 10 800 MHz, 95% H2O, 5°C 1H (ppm)

Powody, dla których dotychczas wyznaczono niewiele struktur oligonukleotydów DNA mało interesujące – podwójna helisa, parowanieW-C RNA – interesujące, ale znacznie trudniejsze: widma trudniejsze w interpretacji – degeneracja przesunięć chemicznych w cukrach, trudne w otrzymywaniu: trzeba dysponować znakowanymi trójfosforanami rybonukleotydów, matrycą DNA i polimerazą RNA; niska wydajność, bardzo trudne w utrzymaniu: rozkład powodują ślady metali, nukleazy, autoliza i znikają