Metody badań strukturalnych w biotechnologii Wykład III Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego – podstawowe pojęcia

Magnetyczny rezonans jądrowy – NMR (Nuclear Magnetic Resonance) – podstawą metody jest wykorzystanie właściwości magnetycznych cząsteczek, związanych z występowaniem w nich jąder magnetycznych

Kilka faktów z historii rozwoju NMR: 1946 – wykrycie zjawiska magnetycznego rezonansu jądrowego, 1955 – spektrometry 1H NMR 40MHz, 1965 – opracowanie algorytmu szybkiej transformacji Fouriera (FFT), 1974 – początek rozwoju metod dwuwymiarowych (2D NMR), 1985 – metoda określania III-rzędowej struktury białek w roztworze za pomocą spektroskopii NMR, 1995 – komercyjnie dostępne spektrometry z magnesami nadprzewodnościowymi, umożliwiające wykonanie widm wielowymiarowych o częstości podstawowej 1H NMR 200 – 750 (obecnie do 900) MHz

Normalnie położenie spinów jądrowych jest przypadkowe:

A po przyłożeniu zewnętrznego pola magnetycznego:

Warunek rezonansu:

Warunek rezonansu:

Właściwości jąder atomowych badanych za pomocą NMR: izotop Zawartość procentowa w populacji Kwantowa liczba spinowa jądra I Częstość rezonansowa MHz (B0 = 2.3T) 1H 99.98 ½ 100 13C 1.08 25.1 15N 0.365 10.1 17O 3.7•10-2 5/2 13.5 19F 94 31P 40.5

Metody rejestracji widm NMR: Metoda fali ciągłej – CW (continuous wave), Metoda impulsowa, znacznie lepsza i nowocześniejsza, polegajaca na rejestracji FID (Free Induction Delay) i zastosowaniu transformacji Fouriera do jego obróbki

Metoda fali ciągłej

Metoda impulsowa FID w funkcji czasu → widmo uzyskane po transformacji Fouriera

FT NMR

1H NMR – protonowy rezonans magnetyczny Na powszechne zastosowanie tej metody składa sie kilka zalet: łatwość przygotowania próbki, wymagana niewielka ilość związku (10-6 g), krótki czas pomiaru – rzędu kilku minut

Na podstawie jednowymiarowych widm protonowych można wnioskować o budowie prostych związków. Cały problem sprowadza się do określenia trzech wielkości: Wartości przesunięć chemicznych poszczególnych sygnałów na widmie. Multipletowości sygnałów (sprzężenie spin – spin). Intergracja sygnałów.

Przesunięcie chemiczne Na jądro atomowe działa pole mniejsze od przyłożonego pola zewnętrznego – tzw efekt ekranowania, która jest tym większy im większa jest gęstość elektronowa wokół danego jadra: Bef = B0(1 – σ) σ – stała ekranowania Dzięki temu na widmie obserwujemy zróżnicowanie sygnałów w zależności od otoczenia chemicznego protonów.

Przesunięcie chemiczne Bef = B0(1 – σ) σ – stała ekranowania

Różnica stałych ekranowania wzorca i próbki nosi nazwę przesunięcie chemiczne δ, wyrażane jest w ppm (part per milion): δ = B0WZ – B0PR/B0WZ•106 [ppm] Ponieważ z warunku rezonansu wynika, że B0 i ν są do siebie proporcjonalne, zatem: δ = νpr- νwz/νwz•106 Najczęściej stosowanym wzorcem w 1H NMR jest tetrametylosilan (TMS).

Przesunięcie chemiczne Grupa δ [ppm] R-COOH R-COH Ar-H R-OH R-NH2 =CH- -CH2- -CH3 12 –10 11 – 9 9 – 7 6 - 4 4 – 2 6 – 1 5 – 1 3 - 1

Przesunięcie chemiczne

Przesunięcie chemiczne

Dlaczego na widmach NMR pojawiają się multiplety? NH2 CH3

Sprzężenia spinowo-spinowe Kolejnym elementem ułatwiającym analizę widm NMR są sprzężenia spinowo-spinowe, wynikające z oddziaływań momentów magnetycznych jąder. Efektem tego jest podział sygnału na multiplet, ilość linii w multiplecie opisuje wzór: P = 2nI + 1 gdzie: n – liczba równocennych jąder rozszczepiających, I – kwantowa liczba spinowa

sprzężenia spinowo-spinowe

sprzężenia spinowo-spinowe

Liczba równocennych jąder Ilość i intensywności sygnałów w multiplecie dla I = ½: Liczba równocennych jąder Ilość i intensywności sygnałów w multiplecie 1 2 3 4 5 6 1 1 1 2 1 1 3 3 1 1 4 6 4 1 1 5 10 10 5 1 1 6 15 20 15 6 1

Równocenne protony

Ostatnim czynnikiem istotnym w analizie protonowego rezonansu magnetycznego jest krzywa integracji. W przypadku 1H NMR powierzchnia piku jest wielkością wprost proporcjonalą do ilości protonów od których dany pik pochodzi.

Przykład widma 1H NMR: