Metody badań strukturalnych w biotechnologii Wykład 1 Wprowadzenie w zagadnienia spektroskopii Spektroskopia w podczerwieni (IR)

Tematyka wykładu: Wprowadzenie w zagadnienia spektroskopii Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego – podstawowe pojęcia, spektroskopia 1 H, 13 C, 31 P NMR, zastosowanie metod dwuwymiarowych Spektroskopia w podczerwieni – podstawy, interpretacja widm, charakterystyczne pasma absorpcji i ich zastosowanie w analizie strukturalnej Spektroskopia elektronowa (UV-Vis) Metody chiralooptyczne (CD i ORD) i ich zastosowanie w badaniach stereochemicznych Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) Spektrometria masowa – wprowadzenie, proces fragmentacji, interpretacja widm, zastosowanie dobadania struktury biopolimerów.

Zalecana literatura: 1.W. Zieliński, A. Rajca Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych WNT Warszawa Z. Kęcki Podstawy spektroskopii molekularnej PWN Warszawa R.M. Silverstein, F.X. Webster, D.J. Kiemle Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych PWN Warszawa H. Günther NMR spectroscopy J. Wiley & Sons 1998

Spektroskopia – badanie oddziaływań pomiędzy materią a promienowaniem elektromagnetycznym. Związek energii przenoszonej przez kwanty promieniowania z wielkościami charakteryzującymi promieniowanie jako falę opisuje równanie Plancka: E = hν = hc/λ gdzie: h –stała Plancka [Js], c – prędkość promieniowania w próżni, λ – długość fali promieniowania [m], ν – częstość promieniowania [Hz, 1/s]

Rodzaje spektroskopii: Metody absorpcyjne – o budowie związku wnioskuje się na podstawie analizy promieniowania elektromagnetycznego zaabsorbowanego przez próbkę, Metody emisyjne – o budowie związku wnioskuje się na podstawie analizy promieniowania emitowanego przez próbkę

Na energię wewnętrzną układu składają się: Energia ruchów translacyjnych cząsteczek, Energia ruchów obrotowych (rotacji), Energia drgań (oscylacji), Energia elektronów, W przypadku gdy badany układ znajduje się w polu magnetycznym należy uwzględnić energię związaną z ukierunkowaniem spinów niesparowanych elektronów lub jąder wykazujących właściwości magnetyczne

Promieniowanie elektromagnetyczne

Najczęściej stosowane metody spektroskopii absorpcyjnej : Spektroskopia nadfioletu i swiatla widzialnego – UV-VIS (UltraViolet-VISible), Spektroskopia w podczerwieni (InfraRed – IR), Spektroskopia mikrofalowa (MicroWave – MW), Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (Nuclear Magnetic Resonance – NMR), Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (Electron Paramagnetic Resonance – EPR)

Pomiar spektrometryczny – rejestracja sygnałów detektora, proporcjonalnych do intensywności zjawiska absorpcji – pomiar NMR i EPR Pomiar spektrofotometryczny – porównanie intensywności wiązki padającej i przechodzącej przez dany układ. W celu opisu tego zjawiska stosuje się dwie wielkości: Absorbancja – A Transmitancja - T

Transmitancja – stosunek intensywności promieniowania monochromatycznego po przejściu przez próbkę P do jego intensywności początkowej P 0 T = P/P 0 P0P0 P próbka

Absorbancja – logarytm z odwrotności transmitancji – jest wprost proporcjonalna do ilości cząsteczek absorbujących znajdujących się na drodze promieniowania czyli do stężenia roztworu A = log(1/T) = log(I 0 /I) Absorbancja jest wielkością addytywną

Prawo Lamberta-Beera : Absorbancja A jest wprost proporcjonalna do stężenia i grubości warstwy roztworu: A = εcl Gdzie: c – stężenie [mol/dm 3 ], l – długość drogi optycznej [cm], ε – molowy współczynnik absorpcji charakterystyczny dla związku i rozpuszczalnika

Ogólna charakterystyka różnych rodzajów spektroskopii absorpcyjnej: Rodzaj spektroskopii Zakres promieniowania Rodzaj energii wewnętrznej który ulega zmianie W podczerwieni (IR) Podczerwieni ( cm -1 ) Energie oscylacji i rotacji W nadfiolecie i świetle widzialnym (UV-VIS) Nadfiolet ( nm), widzialny( nm) Energia elektronów

Magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) Radiowy (5-900 MHz) Energia spinów jądrowych w polu magnetycznym Elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) Mikrofalowy ( GHz) Energia spinów niesparowanych elektronów w polu magnetycznym Mikrofalowa MWmikrofalowyEnergia rotacji cząsteczek

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) Badanie struktury związków chemicznych – możliwość obserwacji atomów zawierających jądra magnetyczne ( 1 H, 13 C, 31 P, 19 F, 14 N, 15 N) i określenia ich otoczenia chemicznego Badanie procesów dynamicznych – kinetyka reakcji i równowagi chemiczne Badania konformacyjne makromolekuł – peptydy, białka, polisacharydy, kompleksy typu białko-DNA Projektowanie substancji aktywnych biologicznie

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR): Obserwacja indywiduów chemicznych zawierających niesparowane elektrony – rodniki i jonorodniki, Badanie właściwości i budowy związkòw kompleksowych zawierających jony metali przejściowych (paramagnetyki)

Spektroskopia elektronowa - UV-VIS : Identyfikacja układów wiązań sprzężonych, Badanie procesu koordynacji w związkach kompleksowych, Badania kinetyczne, Spektrofotometryczna analiza ilościowa

Metody chiralooptyczne (ORD i CD): ORD – dyspersja skręcalności optycznej CD – dichroizm kołowy Metody badania budowy przestrzennej związków chiralnych przy użyciu światła spolaryzowanego

Spektrometria masowa : Analiza jonów powstałych w wyniku bombardowania substancji strumieniem elektronów i pomiar charakterystycznego dla nich stosunku masy do ładunku (m/z). Umożliwia to określenie masy cząsteczkowej, wzoru sumarycznego czy nawet wzoru strukturalnego związku.

Zakres podczerwieni obejmuje promieniowanie elektromagnetyczne między a 200cm -1 Atomy w cząsteczce oscylują wokół położeń równowagi. Absorpcja promieniowania podczerwonego powoduje zmiany energii oscylacyjnej molekuły, a jako efekt otrzymuje się widmo oscylacyjne.

Spektroskopia IR

Spektroskopia oscylacyjna Promieniowanie w zakresie podczerwonym stymuluje oscylacje cząsteczki. Widma w podczerwieni są najczęściej zależnością %T (procent transmitancji) w funkcji długości fali (cm -1 ).

Model oscylatora harmonicznego prawo Hooka Reguła wyboru: musi się zmienić moment dipolowy cząsteczki

Wiązania kowalencyjne oscylują tylko w dozwolonych częstościach

Drgania normalne molekuły wody: rozciągające rozciągające nożycowe symetryczne asymetryczne 1595cm cm cm -1

TYPY DRGAŃ GRUPY CH 2 ++ _ + rozciągającedeformacyjne w płaszczyźnie deformacyjne poza płaszczyzną asym 2920 cm -1 sym 2850 cm -1 nożycowe d 1470 cm -1 wahadłowe 720 cm -1 wachlarzowe Skręcające 1300 cm -1

Tylko oscylacje układu, powodujące zmiany jego momentu dipolowego dają pasma absorbcji na widmie – które oscylacje CO 2 dają sygnały na widmie IR? Symetryczne rozciagajace Asymetryczne rozciągajace Zginające (podwójnie zdegenerowane) Spektroskopia IR

Widmo oscylacyjne oddechu ludzkiego

Częstości drgań rozciągających Częstość zmniejsza się ze wzrostem masy atomowej. Częstość wzrasta wraz ze wzrostem energii wiązania.

Schemat spektrometru IR

Zalety stosowania spektroskopii FT-IR: 1.Wyższa czułość, 2.Zastosowanie laserowego źródła promieniowania ułatwia kalibrację 3. Uśrednianie skanów skraca czas pomiaru i podwyższa jakość widma.

Metodyka przygotowania próbek Znane są metody rejestracji widm IR substancji występujących we wszystkich stanach skupienia. Konieczne jest stosowanie kuwet sporządzonych z materiałów przepuszczających promieniowanie podczerwone – NaCl, KCl, KBr, CaF 2, polietylen. Ciecze i ciała stałe rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych. W przypadku substancji trudno rozpuszczalnych stosuje się zawiesinę w oleju parafinowym (nujolu) lub pastylki KBr.

Interpretecja widm IR ZakresCharakterystyka 1300 – 700cm -1 Obszar daktyloskopowy cząsteczki (fingerprint region). Charakterystyczny dla danego związku układ pasm odpowiadających drganiom rozciągającym i deformacyjnym szkieletu molekuły – 1300cm -1 Obszar występowania pasm absorpcji grup funkcyjnych, umożliwiający interpretację widma i określenie grupy do jakiej należy badany układ.

Interpretecja widm IR

Związki karbonylowe W widmach wszystkich związków karbonylowych występuje silne pasmo absorpcji odpowiadające drganiom rozciągającym grupy C=O w rejonie 1900 – 1550cm -1. Na położenie tego pasma wpływa kilka czynników: -sprzężenia z udziałem grupy karbonylowej, -efekt indukcyjny podstawników, -naprężenia pierścienia w układach cyklicznych z grupą karbonylową, -wiązania wodorowe.

rozciągające O-H około cm -1 (wiązania wodorowe) rozciągające C=O około 1715 cm -1

Położenie pasma ν(C=O) w związkach karbonylowych 1807cm cm cm cm -1 Chlorek acetylu Acetamid

Wpływ naprężeń w pierścieniu na częstość pasma ν(C=O) 1715cm cm cm cm cm -1

Zmiana parametrów pasm absorbcji na widmach IR, które są kryteriami istnienia wiązań wodorowych: 1.Niższa częstość drgań rozciągających typu H-X 2.Wyższa intensywność pasm H-X, 3.Poszerzenie pasm H-X,

Wiązanie wodorowe

ROZTWORY IZOBUTANOLU O RÓŻNYCH STĘŻENIACH

Spektroskopia oscylacyjna – wady i zalety W oparciu jedynie o spektroskopię IR nie można określić struktury. Niektóre sygnały na widmie mogą być trudne do zinterpretowania. Brak pasma absorbcji od danej grupy funkcyjnej może być dowodem, że brak tej grupy w badanej strukturze.