Krzysztof Giannopoulos Komórki regulatorowe Krzysztof Giannopoulos Kazimierz Dolny 27 września 2007

Treg występowanie mechanizm działania charakterystyka fenotypowa

Populacje kom. regulatorowych Zylicz et al. Postepy Hig Med. Dosw 2005; 59: 160-171

Liczba publikacji dotyczących Treg (A) i FOXP3 (B) w dazie PubMed

Subpopulacje Treg oraz ekspresja FOXP3 Typ komórek T regulatorowych Pochodzenie Fenotyp Foxp3 Mechanizm działania CD25-Treg ? CD4+ CD25- obecny naturalnie występujące CD4+CD25+Treg nTreg grasica, może być też obwód CD4+ CD25+ CD45RBlow komórka-kontakt rozpuszczalne TGF-β wydzielanie IL-10 IL-10 Treg obwód CD4+ nieobecny Th1 wydzielanie INF-γ i IL-10 Th2 wydzielanie IL-4,IL-10,IL-13 O’Garra et al. Nat Med. 2004; 10: 801-5

Kom. CD4+CD25hi charakteryzuje zwiększona ekspresja FOXP3 Baecher-Allan et al. Semin Cancer Biol. 2006; 16: 98-105

Pochodzenie Treg http://www.bdbiosciences.com

Funkcja ochrony przed autoreaktywnością przez nTreg

Proponowany mechanizm działania nTreg Hamują migrację kom. efektorowych Hamują prezentację antygenów Indukują anergię potencjalnych kom. efektorowych Działają bezpośrednio hamująco na kom. efektorowe Hamują funkcję kom. efektorowych Bezpośrednio indukują apoptozę komórek prezentujących antygen, monocytów i limfocytów B

Wpływ FOXP3 na kom. T IFN-γ FOXP3 IL-4 IL-2

Wpływ FOXP3 na kom. T IFN-γ FOXP3 IL-4 IL-2 Kim et al. EMBO J. 2002; 21: 3051-9

Mechanizm supresji typu „bystander” odpowiada za brak specyficzności działania Treg Beissert et al. J Invest Dermatol. 2006; 126: 15-24

Regulacja odpowiedzi T komórkowej przez aktywację ekspresji IDO w DC Beissert et al. J Invest Dermatol. 2006; 126: 15-24

Proliferacja nTreg i Teff in vivo po stymulacji antygenem CD4+CD25- CD4+CD25+ Shevah et al. Immunol. Rev 2006; 212: 60-73

Zwiększona fosforylacja łańcucha ζ TCR w kom. nTreg Shevah et al. Immunol. Rev 2006; 212: 60-73

CD95L indukuje apoptozę nTreg zależną od ekspresji FOXP3 Fritzsching JI 2005; 175: 32-36

Kom. nTreg indukują apoptozę kom. B Shevah et al. Immunol. Rev 2006; 212: 60-73

Odpowiedź cytotoksyczna limfocytów Treg odbywa się przy udziale granzymów Shevah et al. Immunol. Rev 2006; 212: 60-73

Charakterystyka fenotypowa nTreg Yi et al. Cell Mol Immunol. 2006; 3: 189-95

Markery Treg (CTLA-4) cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4) Nie jest niezbędny do różniowania nTreg, ale odpowiada za funkcję Treg Ng WF, Duggan PJ, Ponchel F, et al. Human CD4()CD25() cells: a naturally occurring population of regulatory T cells. Blood. 2001;98: 2736-2744. Jonuleit H, Schmitt E, Stassen M, Tuettenberg A,Knop J, Enk AH. Identification and functional characterization of human CD4(+)CD25(++) T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood. J Exp Med. 2001;193:1285-1294. Read S, Malmstrom V, Powrie F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 2000;192:295-302. Takahashi T, Tagami T, Yamazaki S, et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25()CD4() regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 2000;192:303-310.

Markery Treg (GITR) glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein (GITR, TNFRSF18) Chroni przed apoptozą zależną od TCR Chroni przed negatywną selekcją w grasicy McHugh RS, Whitters MJ, Piccirillo CA, et al. CD4()CD25() immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 2002;16:311-323. Shimizu J, Yamazaki S, Takahashi T, Ishida Y, Sakaguchi S. Stimulation of CD25()CD4() regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 2002;3:135-142. Yi H, Zhen Y, Jiang L, Zheng J, Zhao Y.The phenotypic characterization of naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells. Cell Mol Immunol. 2006; 3: 189-95.

Markery Treg OX40 antigen (CD134,TNFRSF4), 4-1BB (CD137) OX 40 jest obecny również na aktywowanych limfocytach T po otrzymaniu sygnału z TCR 4-1BB podtrzymuje przeżycie CD4, CD8 i kom. NK oraz indukuje proliferację Treg Takeda I, Ine S, Killeen N, et al. Distinct roles for the OX40-OX40 ligand interaction in regulatory and nonregulatory T cells. J Immunol. 2004;172: 3580-3589. Stephens LA, Barclay AN, Mason D. Phenotypic characterization of regulatory CD4CD25 T cells in rats. Int Immunol. 2004;16:365-375. Zhen Y, Jiang L, Zheng J, Zhao Y.The phenotypic characterization of naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells. Cell Mol Immunol. 2006; 3: 189-95.

Markery Treg Lselectin (CD62L, SELL) Niska ekspresja na powierzchni aktywowanych limfocytów CD4+ Wraz z ekspresją receptorów chemokinowych CCR7 i cząsteczki CD27 wskazuje na fenotyp odpowidający kom. pamięci Szanya V, Ermann J, Taylor C, Holness C, Fathman CG. The subpopulation of CD4CD25 splenocytes that delays adoptive transfer of diabetes expresses L-selectin and high levels of CCR7. J Immunol. 2002;169:2461-2465. Takeda I, Ine S, Killeen N, et al. Distinct roles for the OX40-OX40 ligand interaction in regulatory and nonregulatory T cells. J Immunol. 2004;172: 3580-3589.

Markery Treg forkhead-helix family of transcriptional repressor FOXP1 Forkhead box P3 (FOXP3) forkhead-helix family of transcriptional repressor FOXP1 FOXP2 FOXP3 Khattri R, Cox T, Yasayko SA, Ramsdell F. An essential role for Scurfin in CD4CD25 T regulatory cells. Nat Immunol. 2003;4:337-342. Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 2003;299:1057-1061. Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4CD25 regulatory T cells. Nat Immunol.2003;4:330-336.

Charakterystyka fenotypowa nTreg Yi et al. Cell Mol Immunol. 2006; 3: 189-95

Treg jako CD127loCD25hi Liu et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ Tregs J. Exp. Med. 2006; manuscript submitted. http://www.bdbiosciences.com

Treg u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową

Zwiększony odsetek Treg u chorych na PBL-B Beyer et al. Blood 2005; 106: 2018-25

Treg chorych na PBL-B mają zdolność hamowania kom. efektorowych Beyer et al. Blood 2005; 106: 2018-25

Odczynniki do oznaczania FOXP3 Klon: PCH101 Klon: 150D

Odsetek komórek CD25high Odsetek limfocytów T regulatorowych u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową (PBL-B) we wczesnych stadiach rozwoju choroby. Ocena ekspresji antygenu CD25 na komórkach CD4 (A) oraz FOXP3 (B) przy użyciu cytometrii przepływowej Odsetek komórek CD25high wśród limfocytów CD4 Odsetek komórek FOXP3+ wśród limfocytów CD4 zdrowi (n=2) Chorzy na PBL-B w stadium 0 wg. klasyfikacji Raia (n=5) Chorzy na PBL-B w stadium 1 wg. klasyfikacji Raia (n=9) zdrowi (n=2) Chorzy na PBL-B w stadium 0 wg. klasyfikacji Raia (n=5) Chorzy na PBL-B w stadium 1 wg. klasyfikacji Raia (n=9) A. B. Giannopoulos et al. Acta Haemat. Pol. 2006; 37: 80-86

Materiał: Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej izolowane od 60 chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową (PBL-B) w czasie diagnozy. Średnia wieku: 63.4, 30 chorych w stadium zaawansowania A, 17 w B i 13 w C w klasyfikacji wg. Bineta. Grupa kontrolna: 10 zdrowych w wieku 25 -75 lat, średnio: 56, w tym 6 mężczyzn i 4 kobiety).

Zwiększony odsetek Tregs u chorych na PBL-B, wzrastający w zaawansowanych stadiach PBL-B (wg. Bineta) p=0,35 p=0,01 p=0,001 n=10 n=30 n=17 n=13 Giannopoulos et al. Leukemia 2007 (in press)

Analiza cytometryczna komórek Treg (CD4+CD25++FOXP3+) u chorych z PBL-B A2-R3tetramer*PE CD4*PerCP isomouse*PerCP SSC-Height R1 A B isorat*FITC FSC-Height C isorat*FITC 4,99% 1,8% R15=1.02% CD4*PerCP CD25*APC FOXP3*FITC D E CD4*PerCP Giannopoulos et al. ASH 2006

Swoiste wydzielanie IFN-γ u chorego na PBL-B (wyniki testu ELISpot jako średnia liczba spotów na 20,000 CD8+) NEG PWM IMP R3 FMOD SUR 20 40 Giannopoulos et al. ASH 2006

Swoiste wydzielanie IFN-γ przeciwko antygenom nowotworowym i wirusowym u chorych na PBL-B w zależności od odsetka Treg (wyniki testu ELISpot dla IFN-γ) Treg =8,65% Treg =8,81% Treg =9,47% Chory 1 Chory 3 Chory 2 Treg =10,36% Treg =11,38% Chory 4 Chory 5 Treg =12,75% Treg =12,68% Treg =18,18% Chory 7 Chory 8 Chory 6 Giannopoulos et al. ASH 2006

T cell responses against tumor and viral antigens depend on Tregs frequencies in PBMC of B-CLL. mean number of spots on 20,000 CD8+ cells Treg<10.5% (n=4) Treg>10.5% (n=4) A. B. Giannopoulos et al. ASH 2006

Redukcja liczby Treg u chorych z PBL-B po kuracji talidomidem (D7) oraz po dodaniu do schematu fludarabiny (D12) (A -patients with Tregs > 200 cells/μl, B <200 cells/μl) A. B. Giannopoulos et al. Leukemia 2007 (in press)

Wyniki - brak istotnej różnicy w odsetku Treg u chorych ZAP-70 pozytywnych i negatywnych (10.98% vs. 12.93%, p=0.46) - tendencja do wyższych odsetków Treg u chorych wykazujących zwiększoną ekspresję CD38 (11.02% vs. 15.26% p=0055) słaba korelacja między procentami Tregs, a limfocytozą (r2 =0.079, p=0.029) brak korelacji między wiekiem, a odsetkiem Treg (r2 =0.034, p=0.156).

Wnioski - zwiększone odsetki komórek T regulatorowych występujące u chorych na PBL-B mogą hamować swoistą odpowiedź immunologiczną przeciw antygenom nowotworowym, co może promować ucieczkę kom. PBL-B spod nadzoru immunologicznego i odpowiadać za progresję choroby - upośledzona odpowiedź immunologiczna na antygen wirusowy IMP może tłumaczyć zwiększoną zapadalność na grypę u chorych na PBL-B

Treg u chorych na szpiczaka mnogiego

Zwiększona ekspresja markerów Treg u chorych z MGUS i MM Beyer et al. Blood 2006; 107: 3940-9

Zwiększony odsetek dziewiczych Treg u chorych z MGUS i MM (A) Beyer et al. Blood 2006; 107: 3940-9

Zwiększona liczba TREC (TCR excision circles) wśród dziewiczych Treg Beyer et al. Blood 2006; 107: 3940-9

Odsetki kom. CD4+CD25+ i CD4+FOXP3+ u chorych z MGUS i MM Yi et al. Blood 2006; 107: 8-9

Odsetek Treg u zdowych (HV) oraz chorych na szpiczaka mnogiego (MM) CD4+CD25highFOXP3+ (% of CD4+cells) p=0,0029 HV MM n=12 n=17 Trześniewska et al. Acta Haemat. Pol. 2007; 38:61-68

Zwiększony odsetek Treg u chorych z MGUS i MM Beyer et al. Blood 2006; 107: 3940-9

Treg u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową

Bezpośredni kontakt Treg z kom Bezpośredni kontakt Treg z kom. efektorowymi stanowi głowny mechanizm immunosupresyjny Chen et al. IJO 2007 (in press)

Charakterystyka cytokin wydzielanych przez Treg Chen et al. IJO 2007 (in press)

Wpływ Imatinibu na Treg Bez Imatinibu 1μM Imatinibu 5μM Imatinibu 10μM Imatinibu Chen et al. IJO 2007 (in press)

Uniwersytet w Ulm Akademia Medyczna w Lublinie Internal Medicine III (Prof. Hartmut Döhner) Akademia Medyczna w Lublinie Klinika Hematoonkologii (Prof. Anna Dmoszyńska) Małgorzata Kowal Wioletta Trześniewska Ewa Wąsik-Szczepanek Paulina Własiuk Grant KBN N40203431/1138 Tumor Immunology Group (Prof. Michael Schmitt) Jinfei Chen Zakład Immunologii Klnicznej (Prof. Jacek Roliński) Agnieszka Bojarska-Junak