Błasiak Ewa Duda Katarzyna Produkcja witaminy C - podejście biotechnologiczne Błasiak Ewa Duda Katarzyna

Witamina C = L-askorbinowy tzn.: "bez szkorbutu" ( "a" = brak, "scorbutus" = szkorbut) Dawniej szkorbut był chorobą popularną wśród marynarzy, którym podczas długich rejsów brakowało świeżych warzyw i owoców, czyli źródła witaminy C. To właśnie dzięki tej chorobie uświadomiono sobie ogromne znaczenie witamin dla zdrowia, i życia człowieka. 1932 r. Albert von Szent Gyorgyi

Witamina C … Udział w wytwarzaniu kolagenu Właściwości antyoksydacyjne, Zapewnia sprawne funkcjonowanie układu krwionośnego, a co za tym idzie – serca, obniża poziom cholesterolu. Wpływa na podnoszenie odporności organizmu (być może właściwości antywirusowe) - pobudza system immunologiczny

…Witamina C Do produkcji hormonów zwalczających stres. Pomaga we wchłanianiu Fe, Mn, oraz zmniejsza toksyczność Se, Cu, V, Co i Hg. Niezbędna dla cukrzyków (wpływ na poziom glukozy we krwi) Kosmetyki Chroni skórę przed działaniem słońca i przed starzeniem. …. UWAGA! W niektórych przypadkach witamina C ma właściwości prooksydacyjne – duże stężenie metali, odpow. pH.

Witamina C – jako antyoksydant Właściwości antyoksydacyjne posiada forma jonowa witaminy C - przejmuje ona elektron z wolnego rodnika – tworzy się wolny rodnik askorbowy, który jest następnie : - utleniany przez oksydazę askorbinową do dehydroksyaskorbinianu (DHA), które reduktaza dehydroksyaskorbinowa redukuje do formy jonowej witaminy, - redukowany przez reduktazę semidehydroaskorbinianowej do formy jonowej witaminy

C wit C =1-5 mM w liściach , 25mM w chloroplastach Synteza witaminy C ROŚLINY – każda komórka roślina ma zdolność do jej syntezy, aczkolwiek większe jej ilości są znajdowane w tkankach merystematycznych, znajduje się w obrębie całej komórki – najwięcej jest jej w chloroplastach C wit C =1-5 mM w liściach , 25mM w chloroplastach ZWIERZĘTA – zachodzi w wątrobie i/lub w nerkach, nie wszystkie potrafią ją syntetyzować, nie robią tego: naczelne - w tym człowiek, świnka gwinea, niektóre ryby i ptaki – u nich gen kodujący L –glukonolaktono oksydazę jest zmutowany – nie prowadzi do syntezy prawidłowego enzymu

zwierzęta kontra rośliny Biosynteza L-AA zwierzęta kontra rośliny

Gdzie ją znaleźć? Znaczące ilości są w warzywach i owocach. Zboża, mleko i mięso zawierają tylko śladowe ilości albo nie zawierają jej wcale. W Polsce: Owoce dzikiej róży - jedna z odmian zawiera w 100 g, ok. 2400mg wit. C (minimalna dzienna dawka to ok. 60 mg) Natka pietruszki. Inne produkty bogate w witaminę C to: truskawki, czarne porzeczki, cytryny, pomarańcze, kiwi, grejpfruty, chrzan, papryka, rzeżucha, koperek zielony.

Czy nie za mało? 75 mg/dzień dla kobiet 90 mg/ dzień dla mężczyzn 100 mg/ dzień dla polaczy

Produkcja 80 000 ton rocznie = koszt $600 mln (produkcja wzrasta 3-4% rocznie) – 50% farmakologia, 25% - żywność, 15% przemysł kosmetyczny, 10% - przemysł rolniczy; Obecnie standardową jest proces Reichsteina obejmujący 7 etapów Witaminy C nie otrzymujemy z roślin ponieważ: - za droga metoda (HPLC), - za małe ilości witaminy się otrzymuje, - Nie ma sensu ponieważ lepiej zjeść warzywko!

Proces Reichsteina Wynalezienie procesu ok. 60 lat temu Wydajność 50% (od D- glukozy do kwasu L- askorbinowego), Proces wieloetapowy wymagający różnych odczynników organicznych i nieorganicznych oraz różnych temperatur dla poszczególnych reakcji, WNIOSEK: Proces trudny do przeprowadzenia i kosztowny!

Biosynteza L-AA w roślinach Główny szlak biosyntezy wymaga L-galaktozy Prekursorem jest L-galaktono-1,4-lakton. Droga przebiega przez GDP-D-mannozę i GDP-L-galaktozę (pathway 1 in figure). Alternatywny szlak biosyntezy zawiera kwas D-galakturonowy jako prekursor L-galaktono-1,4-laktonu. Główne enzymy tego szlaku poznano dopiero w 1998 r.

GLOaza – L- glukonolaktono oksydaza GLOaza – utlenia L- gulonolakton do kwasu askorbinowego u zwierząt (2000)

Lactuca sativa Nicotina tabacum Zwiększona ilość produkcji witaminy C w roślinach przyczyniła się do: wzrostu ich odżywczych właściwości oraz do zapobiegania ich brązowieniu.

Chlorella pyrenoidosa Chlorella pyrenoidosa próbowano wykorzystać jako źródło witaminy C ponieważ: łatwo dostępna, prosta do hodowli, zawiera stosunkowo dużo witaminy C (tzn. więcej aniżeli owoce czy warzywa). Produkcję przeprowadzano w bioreaktorze uzyskując początkowo 40mg/l L-AA, po przypadkowej mutagenezie i optymalizacji warunków udało się otrzymywać 2g/l (na początkowo dodanej 80g/l glukozy => wydajność procesu 2,5%) (1996 patent na otrzymywanie wit. C z zielenicy)

Drożdże & D-EAA  D-Ara DH, D-arabinose dehydrogenase D-AL Ox, D-arabinono-1,4-lactone oxidase; L-Gal DH, L-galactose dehydrogenase; GDPME, GDP-D-mannose-3,5-epimerase; GDPM PPase, GDP-D-mannose pyrophosphorylase L-GL DH, L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase HK, hexokinase PGI, phosphoglucose isomerase PMI, phosphomannose isomerase PMM, phosphomannose mutase D-EAA (Kwas D-erytroaskorbinowy) ma podobnie do L-AA właściwości antyoksydacyjne, ale nie pełni pozostałych funkcji, które normalnie spełnia witamina C w organiźmie (jka np. stymulacja syntezy kolagenu).

Co się stanie gdy.....? Do hodowli S.cerevisiae dodano prekursory witaminy C.

Wnioski D –arabinozo dehhydrogenaza i D –arabinozo oksydaza nie są bardzo specyficzne, ich substratem mogą być zarówno prekursor L-AA i D-EAA (identyczna wydajność procesu) – współzawodnictwo pomiędzy nimi o miejsce aktywne enzymu Doświadczenie wskazuje na nową, alternatywną metodę produkcji witaminy C. Na tym etapie nie jest ona opłacalna bo L- galaktoza jest bardzo rzadkim i drogim cukrem. Obecnie pracuje się nad utworzeniem nowego szczepu drożdży, które posiadałyby enzymy mogące przekształcać D- glukozę w L-galaktozę (projekt wspierany przez firmę Roche).

Bakterie Stosowane głównie do otrzymywania intemediantów procesu Reichsteina, co pozwoli skrócić i usprawnić proces Zastosowanie ukladu z NADP / NADPH Otrzymywanie 2 – keto L- glukonu poprzez: - Oksydacja l-glukozy do 2-KLG przez Pantoea citrea (120g/l w czasie 120h), - Oksydację D-sorbitolu / D-sorbozy di 2-KLG przez Gluconobacter oxydans

Podsumowanie  Obecnie są trzy kierunki w biotechnologii, które mają na ulepszenie produkcji witaminy C: Otrzymanie większej ilości L –AA za pomocą manipulacji biosyntezą L- AA, Produkcja witaminy C przez drożdże, Produkcja intermediatów (2- KLG) procesu Reichsteina przez bakterie

THE END THE END