Efektywna szybkość zaniku magnetyzacji poprzecznej wiąże się z szerokością linii zależnością: w = 1/( T 2 *) = (1/ )R 2 * T 2 * - efektywny T 2, doświadczalny parametr określający szybkość zaniku sygnału FID R 2 * - efektywny R 2, doświadczalna stała szybkości zaniku sygnału FID

A – pierwszy impulsewolucja A B x y z x y z M0M0 90 x B - drugi impuls ewolucja B C x y x y Zmiany magnetyzacji próbki podczas sekwencji pomiarowej spinowego echa (Carr i Purcell): A- po pierwszym impulsie, B- przed i po drugim impulsie, C- w chwili echa [d x y - -at] n y x 180 y x y x y x

Przebieg zmian magnetyzacji poprzecznej podczas pomiaru pierwszego echa spinowego (a) likwidacja wpływu niejednorodności pola B 0, przesunięć chemicznych i heterojądrowych stałych sprzężeń spinowo-spinowych; (b) te same zmiany z uwzględnieniem relaksacji, dyfuzji i ewentualnej wymiany chemicznej. 90 x 180 y 90 x 180 y (a) (b)

Do pomiaru szybkości relaksacji poprzecznej stosuje się metodę wielokrotnego echa spinowego – metoda Carra-Purcella- Meibooma-Gilla (CPMG) Przebieg zmian M y pojedynczej linii dla wielokrotnego echa [d x ( y - -) m -at] n

Pomiar T 2 dla 1-bromoetynylo-4-etynylobenzenu: widoczne są różnice szybkości zaniku magnetyzacji poprzecznej dla C-H i -C, a także wygaszanie sygnałów deuterochloroformu. C-H CDCl 3 -C CBr t echo= = 0,02 s t echo= = 0,8 s t echo= = 4 s

c – czas korelacji – czas obrotu o jeden radian. Współczynnik dyfuzji rotacyjnej: D = 1/ (6 c ) J ( ) - gęstość spektralna funkcji korelacji – prawdopodobieństwo pojawiania się fluktuacji zachodzących z częstością ω. J ( ) = 2 c /[1+( c ) 2 ] Warunek granicznego zwężenia : 0 c <<1, wtedy J ( ) = 2 c Parametry opisujące kinetykę ruchu molekularnego

R 1A,DD = (4/3)I X (I X +1) D 2 AX [0,05J ( A – X ) + 0,15J ( A ) + 0,3J ( A + X )] R 2A,DD = (4/3)I X (I X +1) D 2 AX [0,1J (0) + 0,025J ( A – X ) + 0,075J ( A ) + 0,15J ( X ) + 0,15J ( A + X )] Dodatkowy parametr relaksacyjny – szybkość relaksacji wzajemnej – opisuje przenoszenie magnetyzacji z jednego spinu na drugi: s AX = (4/3)I A (I A +1) D 2 AX [0,3J ( A + X ) – 0,05J ( A – X )] gdzie D AX, to stała sprzężenia dipolowego : D AX = –( 0 /4 ) A X ħ/r przenikalność magnetyczna próżni r AX – odległość sprzężonych jąder I A - spin jądra obserwowanego I X - spin jądra stanowiącego źródło pola magnetycznego Relaksacja dipolowa

C(para)C(meta)C(orto)C(ipso) C( ) T 1 (s)1,12201,4619,614,11,10 R 1 (s -1 )0,8930,0500,6850,0510,0710,909 T 1,DD (s)1,26331, ,27 R 1,DD (s -1 )0,7940,0300,6130,0230,0170,786 Wpływ sąsiedztwa atomów wodoru na szybkość relaksacji spinowo-sieciowej jąder 13 C w 3,5-dichlorofenyloacetylenie ( DMSO-d 6, 30°C, 4.7T).

Zależność szybkości relaksacji podłużnej, poprzecznej i relaksacji wzajemnej od czasu korelacji, c w układzie spinów 1 H – 13 C (odległość H-C = 0,11 nm, B 0 = 11,7 T).

R 1,Q = 0,3 2 [(2I+3)/(I 2 (2I–1))] 2 (1+ 2 /3)[0,1J( 0 )+0,4J(2 0 )] R 2,Q = 0,3 2 [(2I+3)/(I 2 (2I–1))] 2 (1+ 2 /3)[0,15J(0)+0,25J( 0 )+0,1J(2 0 )] Gdzie jest stałą sprzężenia kwadrupolowego, a współczynnikiem asymetrii tensora EFG = (e 2 Qq)/h Relaksacja kwadrupolowa spinu I> ½

Sygnał 1 H NMR grupy NH 3 chlorowodorku t-butyloaminy. Szybkość reorientacji cząsteczki badanej spełnia we wszystkich przypadkach warunek granicznego zwężenia (ω 0 c << 1)

Definicja współczynnika wzmocnienia NOE : A = (M Az – M A z 0 )/M Az 0 Efekt NOE powstaje w wyniku relaksacji dipolowej: R 1 /R 1DD = (R 1DD + R 1 *)/R 1DD = max / W przypadku szybkich ruchów molekularnych graniczna wartość współczynnika NOE wynosi: X,max. = 1 + H /2 X W przypadku homojądrowym w obszarze granicznego zwężenia: = 0,5 a dla powolnej reorientacji (ω A c >> 1): = –1 Jądrowy efekt Overhausera (NOE)

Sekwencje stosowane do obserwacji dynamicznego NOE przy różnych stanach początkowych spinów A: (a) M Az (0) = M Az 0 oraz (b) M Az (0) = M Az 0 at M(t)/M 0 H

1.Racjonalne zaprojektowanie pomiarów widm NMR, zwłaszcza dla jąder innych niż 1 H, wymaga uwzględnienia zjawisk relaksacji. 2.Problem relaksacji pojawia się we wszystkich bardziej zaawansowanych interpretacjach widm NMR. 3.Własności relaksacyjne protonów są podstawą większości technik uzyskiwania obrazów tomograficznych metodami MRI, FMRI czy MRS organizmów żywych. 4.Pomiary szybkości procesów relaksacyjnych umożliwiają badanie dynamiki ruchów molekuł w roztworach i ruchów konformacyjnych, co ma związek z funkcjonowaniem biomolekuł w układach biologicznych. Znaczenie magnetycznej relaksacji jądrowej

Czułość pomiarów NMR

Intensywność ~ [stężenie] (Int ~ c) Efekt akumulacji: S/N ~ nt 1/2 nt – liczba zsumowanych sygnałów FID Moment magnetyczny jądra i pole B 0 : Int ~ (5/2) B 0 (3/2) Efekt NOE: Int( max ) = (1 + S /2 I ) Int 0 Przeniesienie polaryzacji S I: Int max = S / I Niektóre czynniki wpływające na jakość rejestrowanego widma

Schemat sekwencji INEPT ogniskowany (INEPT = Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer) Wąskie prostokąty reprezentują impulsy 90º a szerokie – impulsy 180º. Inne oznaczenia: t d – przerwa relaksacyjna, w której układ dochodzi do stanu równowagi termodynamicznej z otoczeniem, d 2 = 1/(4J), d 3 = (0,15 - 0,25)/J, at – czas rejestracji FID t d d 2 d 3 d 3 d 2 odsprz. I S A BCDE at

Postać multipletów spinu I w grupach IS, IS 2 i IS 3, rejestrowanych za pomocą sekwencji INEPT z kompensacją równowagowej intensywności spinu I. CH CH 2 CH 3

Wzmocnienie sygnału spinów I spowodowane przeniesieniem polaryzacji od spinów S w technice DEPT Układ spinowy = 45º = 90º = 135º IS 0,71( S / I )( S / I )0,71( S / I ) IS 2 ( S / I ) 0 –( S / I ) IS 3 1,06( S / I ) 0

Standardowe widmo 13 C NMR i widmo DEPT(135) próbki sacharozy zanieczyszczonej metanolem, zarejestrowane z odsprzęganiem od protonów

Sygnał główny i sygnały satelitarne acetylenowego protonu 1-bromoetynylo-4- etynylobenzenu C-H ppm

Niektóre zaawansowane techniki pomiarowe

Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej Sekwencja pomiarowa służąca do rejestracji standardowego widma 1D NMR: (t d ) – (impuls ) – (at) Sekwencja pomiarowa służąca do rejestracji widma 2D NMR: (t d ) – (t 1 ) – (t m ) – (at) Sekwencja pomiarowa służąca do rejestracji widma 3D NMR: (t d ) – (t 1 ) – (t m ) – (t 3 ) – (t m2 ) – (at)

Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej Poglądowe przedstawienie dwuwymiarowej spektroskopii NMR

Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej Etapy sekwencji pomiaru widma dwuwymiarowego: przygotowanie, t d - wytwarzany jest nierównowagowy stan układu spinowego inkrementowany czas ewolucji, t 1 - znakowanie koherencji spinowych częstościami 1 mieszanie, t m - przeniesienie koherencji pomiędzy oddziałującymi spinami detekcja, t 2 - rejestracja sygnału FID, zawierającego informacje bezpośrednio o częstościach 2 i pośrednio o częstościach 1

Dwuwymiarowa technika COSY Sekwencja COSY służąca do korelowania przesunięć chemicznych spinów oddziałujących skalarnie 90 x

Dwuwymiarowa technika COSY Schematycznie przedstawione widmo 2D typu COSY, w którym korelacja spinów jest wywoływana sprzężeniem skalarnym. Sygnały diagonalne (D) odpowiadają widmu 1D podczas gdy sygnały niediagonalne wskazują na obecność sprzężenia skalarnego pomiędzy spinami.

WIDMO PROTONOWE KROTONIANU ETYLU HHH H H

WIDMO COSY KROTONIANU ETYLU

Widmo 1D 1 H NMR. Widmo 1D 1 H NMR roztworu sacharozy w D 2 O z dodatkiem metanolu

Widma COSY z filtrem dwukwantowym - DQF-COSY. Widmo 2D 1 H- 1 H DQF-COSY roztworu sacharozy w D 2 O z dodatkiem metanolu

Widmo 1D 1 H NMR roztworu sacharozy w D 2 O z dodatkiem metanolu Widmo 1D 1 H NMR.

Widmo 1D 1 H NMR teakryny w CDCl 3

Widmo 1D 13 C NMR teakryny w CDCl CDCl 3

Detekcja odwrotna. Widmo 2D 1 H- 13 C HMBC teakryny H7 C5 C8 H9 C4 H3 C2 H1 C6

Widmo 1D 1 H NMR teakryny w CDCl

Widmo 1D 13 C NMR teakryny w CDCl

Detekcja odwrotna. Widmo 2D 1 H- 13 C HSQC teakryny H7 H9 H3 H1 C9C7C1C3

Widmo 1D 13 C NMR teakryny w CDCl

Impulsowe gradienty pola magnetycznego Częstość precesji spinów w polu magnetycznym B 0 z nałożonym liniowym gradientem: | L (z)| = (B 0 + g z z) (a)Dwa impulsy gradientowe o przeciwnej polaryzacji stanowiące najprostszą sekwencję ogniskującą (b)Sekwencja gradientowego echa spinowego

Najważniejsze techniki dwuwymiarowej spektroskopii NMR TechnikaInformacja Korelacje poprzez homojądrowe J ij; współrzędne δ(H i ), δ(H j ) Cosy (Correlation spectroscopy)sprzężenia par jąder DQCOSY (Double-Quantum Correlation COSY ) lepiej czytelne COSY, brak sygnałów singletowych na diagonali TOCSY (total correlation spectroscopy)wszystkie sprzężenia w obrębie całego układu spinowego Korelacje poprzez heterojądrowe J ij; współrzędne δ(X i ), δ(H j ) (detekcja odwrotna) HSQC (heteronuclear single quantum correlation) sprzężenia przez jedno wiązanie HMBC (heteronuclear multi bondcorrelation) sprzężenia przez więcej niż jedno wiązanie HMQC (heteronuclear multi quantum correlation) sprzężenia przez jedno lub więcej wiązań (mniej selektywne) Korelacje poprzez oddziaływania dipolowe (NOE); współrzędne δ(H i ), δ(H j ) NOESY (NOE spectroscopy) odległość pomiędzy H i i H j ; zanika jeśli ω 0 c ~1 ROESY (rotating frame NOE SY) odległości międzyjądrowe; działa również dla ω 0 c =1 Korelacje przez wymianę chemiczną; współrzędne δ(X), δ(X) EXSY (exchange SY)schemat i szybkość wymiany chemicznej