Techniki chromatograficzne CHROMATOGRAFIA GAZOWA

Paweł Sroka p. 1.113 tel. 0 12 662 47 97

Techniki chromatograficzne Literatura Witkiewicz Z., Hetper J. „Chromatografia gazowa” PWN, 2001. Jennings W., Mittlefehldt E., Stremple P. „Analitical Gas Chromatography” Academic Press, 1997. Wittkowski R., Matissek R. „Capillary Gas Chromatography in Food Control and Research” Technomic Publishing, 1993.

Techniki chromatograficzne Zastosowanie GC Analiza jakościową i ilościową złożonych mieszanin lotnych związków organicznych występujących w normalnych warunkach jako gazy ciecze i ciała stałe. Automatyczna kontrola i sterowanie procesami przemysłowymi Preparatywne wydzielanie składników mieszanin Badania fizykochemiczne

Techniki chromatograficzne W chromatografii spotykamy dwa rodzaje faz: ruchomą i stacjonarną. Fazy ruchome gaz (chromatografia gazowa GC) ciecz (chromatografia cieczowa LC) fluid nadkrytyczny (chromatografia fluidalna)

Techniki chromatograficzne Fazy stacjonarne: ciało stałe (chromatografia ADSORPCYJNA) ciecz (chromatografia PODZIAŁOWA) Stała podziału Ka jest proporcjonalna do stężenia składnika A w fazie stacjonarnej CAs i odwrotnie proporcjonalna do stężenia w fazie ruchomej CAr. KA = CAs/CAr

Gazy nośne stosowane w GC wodór azot argon hel ksenon mieszaniny gazów Faza ruchoma Gazy nośne stosowane w GC wodór azot argon hel ksenon mieszaniny gazów

Warunki jakie musi spełniać faza ruchoma obojętność w stosunku do składników próbki wymagania związane z rodzajem zastosowanego detektora bezpieczeństwo pracy dostępność i cena

Faza stacjonarna Fazy stacjonarne zbudowane są z następujących grup związków: adsorbenty nieorganiczne (naturalne i syntetyczne zeolity, sadze grafityzowane) węglowodory silikony poliglikole estry ciekłe kryształy cyklodekstryny

Schemat GC 1 – blok regulacji gazów, 2 – termostat kolumny, 3 – kolumna, 4 – dozownik, 5 – detektor

GC

GC

Schemat linii gazu nośnego w GC 1 – butla ze sprężonym gazem, 2 – zawór redukcyjny, 3 – filtry, 4 – regulator przepływu gazu, 5 – wskaźnik ciśnienia gazu, 6 – dozownik, 7 – kolumna, 8 – detektor, 9 – wylot gazu nośnego

GC

Producenci chromatografów gazowych GC Producenci chromatografów gazowych Agilent Technologies (Hewlett-Packard) Perkin Elmer Varian Carlo Erba Unicam Shimadzu

Próbkę można dozować do GC w postaci Dozownik Próbkę można dozować do GC w postaci gazowej – zawór dozujący (pętla dozownicza) lub strzykawka ciekłej – mikrostrzykawka (1-10 l)

Dozownik Próbka wprowadzona do kolumny nie może być większa od pojemności sorpcyjnej kolumny, ponieważ jej przeładowanie prowadzi do powstawania szerokich, niesymetrycznych pików i złego rozdzielenia składników próbki. (Dotyczy to głownie kolumn kapilarnych).

Dozownik Dla większości kolumn kapilarnych dopuszczalna wielkość próbki wynosi 0,01–0,001l cieczy. Tylko dla szerokich kapilar o średnicy 0,53 mm można dozować próbki takie jak do kolumn pakowanych (1–5 μm). Z tego powodu w kapilarnej chromatografii gazowej stosuje się często dzielniki strumienia gazu nośnego zwane splitterami.

Dozownik

Materiał z którego wykonano kolumnę metalowe (stal, miedź, aluminium) Kolumny Kolumny pakowane kapilarne (70%) Materiał z którego wykonano kolumnę metalowe (stal, miedź, aluminium) szklane kwarcowe

Kolumny różnią się także rodzajem i sposobem wypełnienia długością średnicą wewnętrzną grubością filmu stopniem usieciowana

Kolumny

Kolumny

Rozróżnia się następujące typy kolumn kapilarnych: Kolumny Rozróżnia się następujące typy kolumn kapilarnych: Z gładkimi ściankami pokrytymi ciekłą fazą stacjonarną (wall–coated open tubular — WCOT) Z warstwą porowatą (adsorbentem) na ściankach (porous layer open tubular — PLOT) Na ścianki których naniesiono nośnik nasycony ciekłą fazą stacjonarną (support–coated open tubular — SCOT)

Kolumny – grubość filmu Grubość warstwy stacjonarnej zwykle wynosi od 0,1–0,3 m. Im cieńsza warstwa, tym kolumna sprawniejsza i krótsze są czasy rozdzielania. Gry warstwa jest grubsza, wówczas pojemność sorpcyjna kolumny jest większa i lepsze jest pokrycie ścianek kolumny. Kolumny z grubszą warstwą fazy stacjonarnej należy stosować do analiz substancji lotnych.

Kolumny – grubość filmu

Kolumny – średnica wewnętrzna Rozdzielczość Szybkość rozdziału Pojemność sorpcyjna 100 m Bardzo wysoka Bardzo wysoka Dostateczna 250 m 320 m Wysoka 530 m

Ważnymi parametrami które charakteryzują fazy stacjonarne to: Kolumny Ważnymi parametrami które charakteryzują fazy stacjonarne to: zakres temperatur pracy polarność  

Substancje polarne — rozdzielamy na polarnej fazie stacjonarnej Kolumny Substancje polarne — rozdzielamy na polarnej fazie stacjonarnej Substancje niepolarne — rozdzielamy na niepolarnej fazie stacjonarnej    Na fazach stacjonarnych niepolarnych – substancje niepolarne są eluowane z kolumny w kolejności ich temperatur wrzenia (ich lotności).

DETEKTORY STOSOWANE W GC  Detektory stężeniowe — reagują na zmianę stężenia próbki oznaczanej w jednostce czasu i wymagające w związku z tym bardzo precyzyjnego ustalenia szybkości przepływu gazu nośnego przez detektor (TCD).  Detektory masowe — ich odpowiedz jest proporcjonalna do całkowitej masy komponentu eluowanego z kolumny i są niewrażliwe na wahania szybkości przepływu gazu nośnego (FID).

Detektory cechują następujące parametry: Selektywność – działanie selektywne w odniesieniu do jednej lub kilku grup związków np.: ECD, FPD (uniwersalne TCD, FID) Czułość – najmniejsza ilość substancji wywołująca sygnał dwukrotnie większy od poziomu szumów układu. Liniowość detektora wyrażana stosunkiem największego sygnału do najmniejszego, odczytana z krzywej zależności wskazań detektora od wielkości próbki, w zakresie jej prostoliniowego przebiegu.

FID — (Flame Ionisation Detector) detektor płomieniowo jonizacyjny Detektory FID — (Flame Ionisation Detector) detektor płomieniowo jonizacyjny W detektorze tym sygnał chemiczny jest zamieniany na sygnał elektryczny poprzez jonizację substancji (związków organicznych) w płomieniu palnika wodorowego. W wyniku jonizacji powstają jony dodatnie o różnej strukturze, które są zbierane przez elektrodę cylindryczną otaczającą płomień palnika, prąd jest wzmacniany i rejestrowany. Detektor FID spalając próbkę, niszczy ją,. Jest to detektor masowy, którego sygnał zależy od szybkości z jaką wykrywane substancje wchodzą do niego. Graniczna wykrywalność węglowodorów jest rzędu 10 –11 węgla g/s,

FPD — (Flame Photometric Detector) detektor płomieniowo–fotometryczny Detektory FPD — (Flame Photometric Detector) detektor płomieniowo–fotometryczny Bazuje on na pomiarze natężenia charakterystycznego promieniowania emitowanego przez wzbudzone cząstki S2 (394 nm) lub tlenek fosfiny HPO (526 nm), powstające w czasie spalania w bogatym w wodór płomieniu. Związki siarki można także oznaczać za pomocą czulszego detektora siarkowego chemiluminescencyjnego SCD (Sulphur Chemiluminescence Detector) — jest to modyfikowany FID w którym wykorzystuje się czułą i selektywną reakcję chemiluminescencyjną tlenku siarki (SO) i ozonu.

Detektory NPD — detektor azotowo–fosforowy, inne nazwy: alkaliczny detektor płomieniowo jonizacyjny AFID) czy też detektor termojonowy TID (Termionic Detector). Stosuje się do wykrywania śladowych ilości fosforu i azotu oraz związków halogenoorganicznych. W najprostszym przypadku jest to detektor FID, w którym wokół lub w pobliżu płomienia umieszczono sprasowany halogenek metalu alkalicznego. Sole cezu i rubidu stosuje się w detektorach przeznaczonych do wykrywania azotu i fosforu, Sole sodu i potasu — związków fosforu. Pod wpływem ogrzewania jony kryształu soli ulatniają się (powstają termojony) i oddziaływają z termojonami związków opuszczających kolumnę chromatograficzną.

Detektory O–FID — detektor tlenowy – płomieniowo–jonizacyjny Eluat z kolumny wprowadzany jest do pirolizera, w którym znajduje się niezależnie ogrzewana do 1200OC kapilara ze stopu platyny z rodem. Tlenek węgla powstający ze związków zawierających tlen jest następnie uwodorniany w metanizerze w temperaturze 350OC. Detektor ten doskonale nadaje się do oznaczania związków tlenowych w benzynach itp.

Detektory TCD — (Thermal Conductivity Detector) cieplno przewodnościowy (katarometr) Czujnikiem jest spirala (niklowa, wolframowa lub platynowo–irydowa) albo termistor. Cechą tych czujników jest znaczna zmiana ich przewodności elektrycznej ze zmianą temperatury. Dlatego też temperatura detektora musi być ustalona i utrzymywana z dokładnością do dziesiątych części stopnia Celsjusza. Gdy z kolumny wraz z gazem nośnym eluowana jest substancja chromatografowana o innym przewodnictwie cieplnym niż przewodnictwo gazu nośnego, wówczas temperatura, a w wyniku tego i przewodność elektryczna czujnika wzrasta lub maleje.

Detektory ECD (Electron Capture Detector) detektor wychwytu elektronów — jonizacja analizowanych chromatograficznie substancji w tego typu detektorach następuje pod wpływem promieniowania jonizującego. Umożliwia on wykrywanie śladowych ilości związków wykazujących powinowactwo elektronowe, np. tlenu, sześciofluorku siarki, tlenków azotu, halogenowęglowodorów, np. freonów, sprzężonych karbonyli, nitryli azotanów, związków metaloorganicznich, pestycydów halogenoorganicznych i węglowodorów policyklicznych.

Detektory

Detektory

Detektory Zaletą GC jest możliwość połączenia rozdziału chromatograficznego z innymi metodami analitycznymi. Metody spektroskopowe Spektrofotometria cząsteczkowa w zakresie podczerwieni (IR) Spektrometria masowa (MS) Spektrometria magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) Emisyjna spektrometria atomowa (AS)

Detektory Warunki zapewniające skuteczność sprzężenia innych metod analitycznych z GC: Dopasowanie warunków ciśnienia i temperatury gazu opuszczającego kolumnę do tych , które są wymagane w komorze pomiarowej spektrometru. Próg wykrywalności metody spektroskopowej musi być niższy od stężenia analizowanej substancji w gazie nośnym Urządzenie pośrednie sprzęgające z chromatograf ze spektrometrem musi być tak skonstruowane, aby nie następowało zbytnie rozmycie pasma chromatograficznego Czas rejestrowania widma każdego składnika nie może przekraczać czasu jego elucji z kolumny chromatograficznej.

Analiza Tylko w nielicznych przypadkach analiza chromatograficzna może być przeprowadzona w temperaturze otoczenia. W większości zastosowań proces chromatograficzny wymaga podwyższenia, a rzadziej obniżenia temperatury. W wielu przypadkach celowa jest programowana zmiana temperatury kolumny GC podczas analizy. Analizę programową temperatury prowadzi się w przypadkach, gdy różnice lotności składników analizowanej mieszaniny są znaczne.

Analiza jakościowa Chromatografia gazowa należy do najdoskonalszych metod rozdzielania lotnych substancji, jednak jej możliwości w zakresie określania struktury lub identyfikacji związków chemicznych bez przeprowadzania dodatkowych badań innymi technikami analitycznymi są dość ograniczone.

Oznaczenie jakościową wykonuje się wykorzystując: czasy retencji Analiza jakościowa Oznaczenie jakościową wykonuje się wykorzystując: czasy retencji reakcje chemiczne detektory selektywne połączenie chromatografii gazowej z innymi metodami analitycznymi

Analiza ilościowa Chromatografia gazowa jest jedną z nielicznych metod analitycznych, które umożliwiają wykonanie analizy jakościowej i ilościowej złożonych mieszanin w jednym procesie. Dokładność analizy zależy od: jakości chromatografu rodzaju detektora (i zakresu liniowości jego wskazań) sposobu wykonania analizy, zbierania i przeliczania danych

Stosunek proporcjonalności jest różny dla poszczególnych substancji. Analiza ilościowa O ilości substancji w mieszaninie można wnioskować na podstawie: powierzchni i wysokości piku. Stosunek proporcjonalności jest różny dla poszczególnych substancji.

Istnieje kilka metod analizy ilościowej próby Analiza ilościowa Istnieje kilka metod analizy ilościowej próby Metoda kalibracji bezwzględnej (wzorca zewnętrznego) Metoda wzorca wewnętrznego Metoda wzorca wewnętrznego z dodatkiem substancji oznaczanej Metoda normalizacji wewnętrznej

Analiza ilościowa - metoda wzorca zewnętrznego Kalibracja bezwzględna (metoda wzorca zewnętrznego) może być stosowana w każdym przypadku chromatografowania, także gdy: nie wszystkie składniki są obecne na chromatogramie, jeden lub kilka składników są trwale zatrzymywane na kolumnie, niektóre piki nie są rozdzielone.

Analiza ilościowa - metoda wzorca zewnętrznego Bezwzględnie wymagane są: dobry przyrząd (powtarzalne warunki rozdziału) powtarzalne wskazania detektora (bez zmian przez cały czas sporządzania wykresu kalibracyjnego oraz wykonania analizy)

Analiza ilościowa - metoda wzorca zewnętrznego Sposób wykonania analizy Do kolumny dozuje się ściśle określone ilości pojedynczej substancji wzorcowej (lub mieszaniny) o dokładnie znanej zawartości substancji wzorcowej. Substancja wzorcowa musi być taka sama jak substancja oznaczana. Każde dozowanie powtarza się 2-3 razy.

Analiza ilościowa - metoda wzorca zewnętrznego Sposób wykonania analizy Na podstawie otrzymanych średnich rysuje się wykres zależności powierzchni pików od objętości lub stężenia zadozowanego wzorca.

Analiza ilościowa - metoda wzorca wewnętrznego Metoda wzorca wewnętrznego jest stosowana bardzo często, ponieważ przy tym sposobie kalibracji nie jest wymagany przyrząd bardzo wysokiej klasy i oznaczenie może być wykonane w krótszym czasie niż sposobem wzorca zewnętrznego.

Analiza ilościowa - metoda wzorca wewnętrznego Jako wzorzec wewnętrzny stosuje się substancję nie występującą w próbie, a której pik na chromatogramie jest położony blisko pików oznaczanych składników mieszaniny. Ściśle odmierzoną ilość wzorca dodaje się do dokładnie znanej ilości próbki. Otrzymaną mieszaninę dozuje się do kolumny, biorąc do obliczeń wartości średnie z kilku pomiarów.

Analiza ilościowa - metoda wzorca wewnętrznego Procentową zawartość oznaczanego składnika oblicza się zależności: GW ­– masa wzorca dodanego do próbki Si – powierzchnia piku oznaczanego składnika fi – względny współczynnik korekcyjny oznaczanego składnika w odniesieniu do wzorca wewnętrznego Gp – mas analizowanej próbki (bez dodanego wzorca) Sw – powierzchnia piku wzorca

Analiza ilościowa - metoda wzorca wewnętrznego Sposób z dodatkiem substancji oznaczanej Si1 – powierzchnia piku oznaczanego składnika na chromatogramie próbki bez dodatku wzorca Si2 – powierzchnia piku oznaczanego składnika na chromatogramie próbki z dodatkiem wzorca Gp ­– masa próbki GW ­– masa wzorca dodanego do próbki w1/w2 – stosunek masowy zadozowanych próbek (bez wzorca i dodanym wzorcem) Sj1 – powierzchnia piku substancji j na chromatogramie próbki bez dodatku wzorca Sj2 – powierzchnia piku substancji j na chromatogramie próbki z dodatkiem wzorca

Analiza ilościowa - metoda normalizacji wewnętrznej   Sposób normalizacji wewnętrznej wymaga, aby na chromatogramie znajdowały się rozdzielone piki odpowiadające wszystkim składnikom obecnym w próbce. Po 2-3 zadozowaniach próbki mierzy się powierzchnie poszczególnych pików i sumuje się ich wartości średnie. Suma stanowi 100%, a stosunek powierzchni wszystkich pików wyraża zawartość procentową odpowiadających im substancji w próbce Ci.

Analiza ilościowa - metoda normalizacji wewnętrznej  im substancji w próbce Ci. Si – powierzchnia piku i–tej substancji k – liczba składników w próbce   Otrzymane w taki sposób wyniki są obarczone dość dużym błędem i można je przyjąć tylko wtedy, gdy właściwości fizykochemiczne składników próbki są podobne i podobna jest odpowiedz detektora względem każdego z nich.

Analiza ilościowa - metoda normalizacji wewnętrznej  W celu uzyskania wyników bardziej wiarygodnych – wprowadza się współczynniki korekcyjne fi tym celu dodatkowo rozdziela się mieszaninę kalibracyjną zawierającą składniki obecne w próbce. Następnie dla każdego składnika i wyznacza się współczynnik korekcyjny.  im substancji w próbce Ci. %Sip – obliczone pierwotne procentowe zawartości składników w próbce %Siwz – obliczone pierwotne procentowe zawartości składników w mieszaninie wzorcowej