Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska, Berlin, Niemcy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Drogi przenoszenia patogenów związanych ze środowiskiem wodnym Spożycie (z płynami) Wdychanie i aspiracja (z aerozolami) Kontakt (podczas mycia) Droga zakażenia (może wystąpić sepsa oraz zakażenie ogólne) Żołądkowo-jelitowa Oddechowa Skórna (szczególnie przy otarciach), przez błony śluzowe, rany, oczy Bakterie Campylobacter spp. E. coli Salmonella spp. Shigella spp Vibrio cholerae Yersinia spp. Wirusy Adenovirusy Astrowirusy Enterowirusy wirus WZW A wirus WZW E Norowirusy Rotawirusy Sapowirusy Pierwotniaki i robaki jelit Cryptosporidium parvum Dracunculus medinensis Etamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii Legionella pneumophila Mykobakteria (niegruźlicze) Naegleria fowleri Zakażenia Szereg innych czynników w warunkach szczególnego narażenia Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Burkholderia pseudaomallei Mykobakterie (niegruźlicze) Leptospira spp.* Pseudomonas aeruginosa Schistosoma mansoni* L ADENOWIRUS NOROWIRUS ROTAWIRUS L ADENOVIRUS NOROVIRUS ROTAVIRUS J J WHO 2004, Guidelines for Drinking Water Quality EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Struktura ramowa analizy ryzyka Ocena ryzyka *Podstawy naukowe Zarządzanie ryzykiem *Zgodnie z polityką Komunikowanie *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka odpowiednie metody Źródło: WHO Food Safety EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Dzisiaj nie będę mówić o… Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach Liczba kolonii DIN EN ISO 6222 E. coli DIN EN ISO 9308-1 DIN EN ISO 9308-3 DIN EN ISO 9308-1 Enterococci DIN EN ISO 7899-2 DIN EN ISO 7899-1 DIN EN ISO 7899-2 Pseudomonas DIN EN 12780 aeruginosa ... ale raczej o: starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii (wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody, badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

badania liczebności i zakaźności bakteriofagów DNA i RNA pobieranie próbek wody do analizy wirusów oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu filtra z włókna szklanego ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa rola inhibitorów środowiskowych wykrywanie wirusów metodami PCR badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej Phage MS2 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Wykrywanie i oznaczanie liczebności bakteriofagów Fagi F+RNA DIN EN ISO 10705-1:2001 Fagi somatyczne DIN EN ISO 10705-2:2001 Fagi B. fragilis DIN EN ISO 10705-4:2001 Fagi F+RNA F-Pilus Fagi somatyczne F+ Bacterium Bacterium EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Wykrywanie bakteriofagów testem łysinkowym EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Oznaczanie liczebności bakteriofagów w próbkach wody ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Fagi F+RNA Fagi somatyczne DIN 10705-1 10705-02 Szczep Salmonella thyphim. E.Coli/CN żywicielski: ( WG49; NCTC 12484 ) lub ( WG5; ATCC 700078 ) E.coli K-12 Hfr ( ATCC 23631 ) Dolny agar: Tryptone-Yeast-Glucose Agar Modif. Scholten‘s Agar (TYGA) ( MSA ) Górny agar: ssTYGA (0,8% agar) ssMSA (0,8% agar) Kwas nalidyksowy: 100 µg/ml 250 µg/ml Granica wykrywalności: 1 pfu/50 ml 1 pfu/50 ml Fag wzorcowy: MS2 PhiX174 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Morfologia płytek bakteriofagów PRD1 PhiX174 MS2 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Morfologia płytek bakteriofagów C.Fuchs Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych: zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego „Karta przewodnia” Kolifag somatyczny PhiX 174 Ar + Bri 110 100 90 80 70 pfu / ml 60 50 40 30 20 20.4.08 10.5.08 30.5.08 19.6.08 9.7.08 29.7.08 18.8.08 7.9.08 27.9.08 17.10.08 6.11.08 26.11.08 16.12.08 Data x-3s x-2s x x+2s x+3s Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Monitorowanie wirusów – pobieranie prób Związki chemiczne Rozkład statystyczny Wirusy Skupiska! EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Próbobranie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowej Próbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii 100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów 10-litrowa próba wody ( DNA / RNA ) próbka wody surowej Wykrywanie wirusa metodą PCR Pobieranie prób wody o dużej objętości Zmniejszenie objętości próbek (1:1000) Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów Testy wykrywające wirusy Infectivity assays EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wody Cechy wirusa Metody Polarność powierzchniowa kapsydu Adsorpcja / Wymywanie Rozmiar cząsteczki Filtracja membranowa (Ultrafiltracja) Gęstość Ultrawirowanie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Koncentracja wirusów przy użyciu filtrów z włókna szklanego EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

W terenie… EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Włókno szklane – badania polowe dużych objętości Próba wody: 10 litrów 1000 litrów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Oczyszczanie bakteryjnych kwasów nukleinowych (DNA/RNA) z próbek pobranych ze środowiska EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Oczyszczanie DNA i RNA liza etapy mycia elucja Bufor do lizy kroki powtarzane 5 razy 2x 50 µl Bufor do elucji Krzemionka Próbka 5ml 5 min 60°,1400 rpm EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Budowa bakteriofagów i wirusów chorobotwórczych dla ludzi Wirus RNA Wirus DNA Zdjęcia: dzięki uprzejmości J.Y. Scro EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Amplifikacja informacji genetycznej wirusów DNA RNA Białko Odwrotna transkrypcja 5’---CTCAGCGTTACCAT---3’ 3’---GAGTCGCAATGGTA---5’ 5’---CUCAGCGUUACCAU---3’ N---Leu-Ser-Val-Thr---C DNA RNA BIAŁKO Transkrypcja Translacja EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Wykrywanie wirusów metodami PCR konwencjonalne PCR (jakościowe) DNA / RNA PCR czasu rzeczywistego (ilościowe) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Amplifikacja informacji genetycznej wirusów poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) Wirusy DNA Wirusy RNA PCR RT-PCR EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Nested (RT)-PCR NOROWIRUS ADENOWIRUS WZW A WIRUS (nested RT-PCR) (nested PCR) WZW A WIRUS (nested RT-PCR) (Mediagnost R) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Real-Time TaqManTM PCR Łączy amplifikację docelowego DNA z ilościową detekcją amplikonów w tym samym naczyniu Adenowirus 41 wzorzec 102 - 106 kopii Potrzebne są tylko: (1) matryca (próbka DNA) (2) nieoznaczona para dla starterów (3) specyficzna sonda w obrębie amplikonu oznakowana 2 fluorochromami (np. reporter FAM i wygaszacz TAMRA) (4) Mastermix (koktail odczynników) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Real-time PCR Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych Testy / próbki: 1. 5 µl próbka 2. 5 µl próbka + Ad Wzorzec 3. 10 µl próbka 4. 10 µl próbka 1:10 Na amplifikację kwasów nukleinowych z próbek pobranych ze środowiska często negatywnie wpływa obecność inhibitorów. Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Badanie zakaźności adenowirusa Komórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR „Integrated Cell Culture PCR“ (ICC-PCR) (A. Heim) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Metody wykrywania wirusa Metoda wykrywania Hodowla komórkowa RT-PCR ICC-PCR L J J Skraca czas wykrywania J J L J Wykrywa zakaźnego wirusa L L J Wykrywa jedynie żywe organizmy L J J Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli J L J Odporna na wpływ substancji hamujących PCR J L J O zwiększonej czułości EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Badanie zakaźności enterowirusa a) Test TCID50 b) Test łysinkowy kontrolna CVB3 Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Podstawowe techniki monitorowania wirusów - wydajna metoda koncentracji wirusów - skuteczna technika ekstrakcji DNA/RNA systemy PCR dopasowane do wirusów ( PCR, nPCR, RT-PCR, nRT-PCR, Real-time PCR ) systemy hodowli komórkowych do badania zakaźności Techniki zaawansowane: - Multiplex PCR; ICC-PCR, technologia mikroczipowa EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Dziękuję Państwu! EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka