Jacek Wierzchowski Katedra Fizyki i Biofizyki UWM w Olsztynie Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku wodnym: jeszcze raz fototautomeria. Jacek Wierzchowski Katedra Fizyki i Biofizyki UWM w Olsztynie

Fluoryzujące pochodne i analogi puryn, stosowane w badaniach enzymologicznych (przykłady). 2-aminopuryna N1,N6-etenoadenozyna formycyna A 8-azaguanina lmax ~ 360 nm lmax ~ 410 nm lmax ~ 340 nm lmax ~ 390 nm  ~ 0.6  = 0.55  = 0.08  ~ 0.08 ÷ 0.3 Najważniejsze zastosowania: Badania oddziaływań enzym-ligand oraz asocjacji białek, polinukleotydów itd. Badania dynamiki DNA i RNA Fluorymetryczne oznaczanie aktywności enzymów

Czy 8-azaksantyna fluoryzuje? Deaminaza guaninowa (GDA) działa na 8-azaguaninę, produkując 8-azaX: Gdyby produkt fluoryzował, mielibyśmy metodę oznaczania aktywności GDA. Enzym ten jest ważny klinicznie - stanowi marker zakażenia HCV! Inne możliwe pożytki z fluorescencji 8-azaX: Badanie oddziaływań z oksydazą ksantynową. 8-azaX to silny inhibitor urykazy (enzym utleniajacy kwas moczowy). Pochodne metylowe – analogi kofeiny, teofiliny etc. to potencjalne ligandy dla receptorów adenozynowych. Pierwsze podejście: produkt deaminacji 8-azaguaniny nie fluoryzuje 

Własności kwasowo-zasadowe puryn i 8-azapuryn. Związek Główna forma anionowa pKa fluorescencja w pH 7 Guanina (G) 9.2 nie (forma obojętna) 8-azaG 6.5 tak (390 nm) – forma obojętna Ksantyna (X) 7.2 (mieszanina form) 8-azaX 4.7 (monoanion!!) Albert, A. Chemistry of 8-azapurines. Adv. Heterocycl. Chem. 1986, 39, 117-178.

Czy forma obojętna 8-azaX (pH < 5) fluoryzuje? TAK!! ale… (▬▬), absorpcja w pH 2; (▬ ▬), absorpcja w pH 7; (○○○), wzbudzenie fluorescencji w pH 4; (●●●), fluorescencja w 1 mM HCl; (++++), fluorescencja w metanolu.

Tautomeria formy obojętnej 8-azateofiliny: L’abbe G., Persoons M-A., Toppet S. Magn. Res. Chem. 25 (1985), 362-4. Sanchez M.P., Romnero MA, Salas JM, Cardenas DJ, Molina J, Quiros M.. J. Mol. Struct. 344 (1995), 257-264. N(8)H N(7)H DMSO: 80% <20% Kryształ: 100% Wygląda na to, że główną formą 8-azaX jest forma N(8)H. Zatem czy to ona fluoryzuje? Model:

Fluorescencja N8-metylo-azaX: (▬▬), absorpcja w pH 3; (▬ ▬), absorpcja w pH 11; (○○○), wzbudzenie fluorescencji w pH 3; (∆∆∆),wzbudzenie fluorescencji w pH 11. (●●●), fluorescencja w 1 mM HCl; (×××), fluorescencja w pH 11; (++++), fluorescencja w metanolu. Wydajność fluorescencji (pH 9) - 60% (!!!)

Wartości pKa stanu podstawowego: 4.7 (8-azaX) i ~7.2 (N8-m-azaX). Fluorescencja 8-azaX (●--●) i N8-m-azaX (■■), mierzona w 420 nm, jako funkcja pH. Wartości pKa stanu podstawowego: 4.7 (8-azaX) i ~7.2 (N8-m-azaX). ------------------------------------ Ale dlaczego fluorescencja N8-m-azaX poniżej i powyżej 7.2 jest identyczna?

Kwasowość molekuł w stanach wzbudzonych może różnić się znacznie od kwasowości w stanie podstawowym: b-naftol: pKa = 9.3 pK* ~ 2.8 fluorescencja formy anionowej występuje w pH > 2.5 (obok formy obojętnej!) ----------- ; cykl Foerstera pozwala na obliczenie pK* na podstawie widm formy protonowanej i zdysocjowanej: - liczby falowe (w cm-1) przejść 0-0 dla obu form. Przesunięcie widm o 475 cm-1 w temperaturze 300 K oznacza pK* - pK = 1

Jakie jest pK* dla N8-metylo-azaX (pKa ~7.4)? ≈ 29000 cm-1 ≈ 32900 cm-1 pK* - pK ~ - 8 (± 0.5) pK* ~ -0.5 (!!!!) Przykłady literaturowe: Związek pKa pK* ΔpK fenol 10.6 3.6 -7.0 β-naftol 9.3 2.8 -6.5 (piranina) 7.7 1.3 -6.4 3.7 6.9 +3.2

Wytłumaczenie pochodzenia fluorescencji N8-metylo-azaX w środowisku wodnym (420 nm) i metanolowym (340 nm)

A jeśli tak, to… Wytłumaczenie pochodzenia fluorescencji 8-azaX w środowisku wodnym i metanolowym (fototautomeria anionu!) **Zagadka: jakie jest pK* dla 8-azaX?

Dlaczego w środowisku wodnym nie pojawia się forma obojętna związku? dyfuzyjna stała przeniesienia protonu: V-1 = kdif 10-pH[A-]* kdif=5·1010 M-1·s-1 (dla przeniesienia protonu) k1 = k-1(pH=pK*) = V-1/[A-]*= 100.5·5·1010·s-1 ≈ 1.6·1011 s-1; czas przeniesienia protonu 6.3 ps. czas zaniku fluorescencji [AH]* (mierzony w metanolu): 0.85 ns

Pomiary czasów zaniku fluorescencji (J. Sepioł, IChF PAN): Czy rzeczywiście ten sam chromofor świeci w 8-azaX i N8-metylo-8azaX? Pomiary czasów zaniku fluorescencji (J. Sepioł, IChF PAN): Wnioski: ten sam chromofor w obu związkach i całym zakresie pH; w pH < 3 obserwujemy tłumienie dynamiczne.

Trochę wspomnień: Wierzchowski J.; Shugar, D. Luminescence studies on formycin, its aglycone, and their N-methyl derivatives: tautomerism, sites of protonation and phototautomerism. Photochem. Photobiol. 1982, 35, 445-458. Wierzchowski, J.; Szczęśniak, M.; Shugar D. Fluorescence emission properties of the cation of 4-aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidine, an adenine analogue: evidence for phototautomerism. Z. Naturforsch. 1980, 35c, 878-889.

Inne przypadki fototautomerii wśród analogów purynowych: Taylor C.A., El-Bayoumi A.A., Kasha M., 1969, PNAS 63, 253-260. 7-azaindol Wenska G.; Skalski B; Insinska M.; Paszyc S.; Verrall, R.E. Ground and excited state prototropic behavior of 1-(purin-6-yl)-3-methylimidazolium chloride. J. Photochem. Photobiol. A 1997, 108, 135-142. C. Santhosh and P. C. Mishra. Electronic spectra of 2-aminopurine and 2,6-diaminopurine: phototautomerism and fluorescence reabsorption. Spectrochimica Acta Part A: Molecular Spectroscopy, 1991, 47, 1685-1693. S. K. Srivastava and P. C. Mishra. Phototautomerism of the G---C base pair of DNA. Journal of Theoretical Biology, 93, 1981, 655-666.

Puryna + rybozo-1-fosforan → nukleozyd + Pi Zastosowanie w enzymologii: reakcja 8-azaX z fosforylazą ksanozynową (PNPII) z E. coli - (synteza 8-azaksantozyny -???) – B. Kierdaszuk. Puryna + rybozo-1-fosforan → nukleozyd + Pi Warunki: ~100 M 8-azaX, pH ~5, 2 mM rybozo-1-fosforan, 25 C.... Reakcja idzie.... tylko czy to aby na pewno produktem jest 8-azaksantozyna???

... i 9-benzylo-azaX Porównajmy.... Nukleozyd (??) pKa ~ 7.2; pKa ~ 5.7 Anion: absorpcja 305 nm, Anion: absorpcja 279 nm Emisja 440 nm Emisja 365 nm

A jak reaguje PNP ze ssaków? – Brak reakcji!! Co się dzieje? N7-nukleozyd? N8-nukleozyd? N9-nukleozyd? Chyba nie! A jak reaguje PNP ze ssaków? – Brak reakcji!!

Dla porównania: Reakcja E. coli PNP-II z AzaGua: Porównanie widm produktu reakcji z widmami 8-azaguanozyny pokazuje, że w tym wypadku rybozylacja idzie na N-9 (z możliwą małą domieszką innych form). Dlaczego??

Jakie mogą być z tego pożytki? jeśli N8-metylo-azaGuanina jest substratem dla GDA….. to mielibyśmy czułą metodę analityczną dla tego enzymu W kompleksach z białkami procesy ESPT będą przebiegały inaczej niż w wodzie – jak??? Na pewno można odróżnić ligand wolny od związanego…. Aza-analogi kofeiny, teofiliny, teobrominy…… fluorescencyjne badania oddziaływań z receptorami? ------ PNPII – pierwszy enzym rybozylujący puryny (lub analogi) w pozycji innej niż N9?? A w ogóle to dlaczego inne formy PNP rybozylują puryny na N9, jeśli N7-nukleozydy podlegają fosforolizie?

REKLAMA Katedra Fizyki i Biofizyki UWM ogłosi wkrótce konkurs na stanowisko asystenta