„Oocyte-specific expression of Gpr3 is required for maintenance of meiotic arrest in mouse oocytes.” Lisa M.Mehlmann „Ekspresja Gpr3 w oocycie jest wymagana do utrzymania bloku mejotycznego w oocytach myszy” Monika Ostrowska

Oocyty oocyt+komórki pęcherzykowe= pęcherzyk jajnikowy Oocyty zatrzymane są w profazie I utrzymanie profazy zależy od wysokiego poziomu cAMP oocyty,które zakończyły okres wzrostu i zasiedlają duże pęcherzyki z formującą się jamką nabywają zdolność do zapłodnienia wznawiają mejozę w odpowiedzi na wyrzut hormonu LH.. LUB zrobią to samorzutnie jeśli usunie się je z pęcherzyka jajnikowego

Jak powstaje cAMP? Receptor GPR3 stymuluje białko Gs aktywne białko Gs stymuluje cyklazę adenylową aktywność cyklazy adenylowej powoduje wzrost cAMP cAMP aktywuje kinazę A ...ciąg przekazywania informacji.. hamowanie kompleksu cyklinaB -CDK1 oocyt utrzymany w profazie I ?

Co wiemy o GPR3.. Jest receptorem połączonym z białkiem Gs ekspresja Gpr3 mRNA zachodzi zwłaszcza w oocycie, ALE także,choć na niższym poziomie, w otaczających go komórkach pęcherzykowych (GPR3 jest zlokalizowane w oocycie, ale także prezentowane wszędzie w pęcherzyku) Odpowiedzialny za produkcje cAMP w oocycie (co najmniej w dużej części)

GPR3 w oocycie czy w otaczających go komórkach pęcherzykowych jest niezbędny do utrzymania bloku mejotycznego w oocycie?

Interferencja RNA Do oocytów w pęcherzykach jajnikowych wstrzyknięto małe dwuniciowe interferujące RNA- siRNA RNA było skierowane przeciwko Gpr3 zapoczątkowało to sekwencjo-specyficzną degradację mRNA cel: redukcja mRNA kodującego Gpr3 w oocytach

Doświadczenie I Mikroiniekcja siRNA nakierowanego na Gpr3 do oocytów otoczonych pęcherzykiem Grupy: - 50nM Gpr3 siRNA - 5nM Gpr3 siRNA - 100nM mutGpr3 siRNA - 100nM GAPDH siRNA - kontrola- bez mikroiniekcji oocyty w pęcherzykach bez jamki (140-180mikrom średnicy) czas hodowli 3dni izolacja,podział na GV i GVBD, liczenie

Wyniki GVBD : 5nM Gpr3 siRNA - 15% 50nM Gpr3 siRNA - 67% kontrola - 2% 5nM Gpr3 siRNA - 15% 50nM Gpr3 siRNA - 67% mutGpr3 siRNA - 5% GAPDH siRNA - 0% 64% oocytów GVBD z Gpr3 siRNA wyrzuciło ciałko kierunkowe

Wnioski redukcja Gpr3 RNA w obrębie mysiego oocytu powoduje wznowienie mejozy wznowienie podziału mejotycznego w oocytach z Gpr3 siRNA było dozo-zależne

Doświadczenie II RT-PCR Grupy oocytów: - z Gpr3 siRNA - kontrolna - mutGpr3 siRNA przygotowane jednakowe ilości cDNA startery nakierowane przeciwko : Gpr3 i rybosomalnego białka L19 – Rpl19

Wyniki Wstrzykniecie Gpr3 siRNA zmniejszyło ilość Gpr3 mRNA do 10 % w stosunku do obecnego w oocytach kontrolnych. Ilość Rpl 19 mRNA-niezmieniona. mutGpr3 siRNA nie zmniejszyło ilości Gpr3 mRNA

Wnioski RNAi nakierowane na Gpr3 jest specyficzne. Mikroiniekcja Gpr3 siRNA powoduje skuteczną redukcje Gpr 3 RNA w oocytach w pęcherzykach jajnikowych u myszy.

Doświadczenie III Mikroiniekcja siRNA nakierowanego na Gpr3 do oocytów izolowanych/ RT-PCR Grupy oocytów: - 50nM Gpr3 siRNA - kontrola hodowano w obecności 4nM hypoksantyny, przez 26-45h izolacja,podział na GV i GVBD, liczenie RT-PCR jak poprzednio

Wyniki 16% izolowanych oocytów wznowiło mejozę < jest to znacznie mniej w porównaniu z 67% w pęcherzykach> redukcja Gpr3 mRNA mniejsza niż u oocytów w pęcherzykach

Wnioski RNAi powoduje wznowienie mejozy i redukcję Gpr3 mRNA w izolowanych oocytach ale w mniejszym stopniu niż w zamkniętych w pęcherzykach oocytach RNAi jest bardziej efektywna w oocytach otoczonych pęcherzykiem ograniczony czas hodowli oocytów wyizolowanych- nie wystarczający do obniżenia ilości białka Gpr3 wcześniej-istniejącego i efektywnego zredukowania mRNA

Powiązanie z poprzednimi doświadczeniami 70% GVBD obserwowanych po iniekcji siRNA do oocytu to bardzo blisko do 80-90% zaobserwowanych przy usunięciu Gpr3 RNA z zarówno oocytu jak i komórek pęcherzykowych u myszy z knockout-em Gpr3 zdolność do utrzymania profazy I w oocycie u myszy z knockout-em Gpr3 może być uratowana jeśli przeprowadzimy mikroiniekcję RNA kodującego Gpr3 do oocytu otoczonego pęcherzykiem

Podsumowanie Redukcja GPR3 specyficznie w oocycie otoczonym pęcherzykiem powoduje wznowienie mejozy utrzymanie bliku mejotycznego jest zależne od obecności GPR3 w oocycie metoda redukcji RNA w pęcherzykach jajnikowych, które mogą być hodowane przez czas wystarczający do redukcji endogenicznych białek, powinna znaleźć zastosowanie w stosunku do wielu innych białek, które mogą być zaangażowane w zatrzymanie mejozy, wznowienie mejozy, zapłodnienie czy wczesny rozwój zarodkowy

Podsumowanie cz.2 Jest możliwe, że komórki pęcherzykowe mogą produkować cAMP i dostarczać go przez „gap junctions” do oocytu ...ALE ilość produkowanego przez nie cAMP jest niewystarczająca do utrzymania stanu zatrzymania mejozy-za to odpowiada cAMP produkowane przez oocyt mimo to oocyt oddzielony od pęcherzyka spontanicznie wznawia mejozę...dlaczego? Hipoteza: komórki pęchrzykowe wysyłają sygnały pobudzające Gpr3 do aktywności. (hipoteza niepotwierdzona)

Dziękuje za uwagę