ENZYMATYCZNE OZNACZANIE WYBRANYCH PESTYCYDÓW I  AFLATOKSYN ORAZ PRODUKTÓW ICH ROZKŁADU RADIOLITYCZNEGO Angelika Gałęzowska Kierownik pracy: prof. dr hab. M. Trojanowicz Opiekunowie pracy: prof. J.-L. Marty, Uniwersytet w Perpignan; mgr A. Bojanowska-Czajka, Instytut Chemii i Techniki Jądrowej, Warszawa Aflatoksyna B1 (AFT B1) Substancja rakotwórcza LD50 = 9,5 mg/kg dla nowonaro- dzonych myszy, wg BLT-Grub Charakterystyczna fluorescencja Chlorfenwinfos (CFV) Insektycyd i akarycyd do ochrony roślin i warzyw Klasa toksyczności WHO – IB, tzn. LD50 = 31 mg/kg Inhibitor cholinoesterazy Karbendazym (MBC) Fungicyd do ochrony roślin Główny produkt rozkładu benomylu Klasa toksyczności WHO – III, tzn. LD50 >10 000 mg/kg Inhibitor β-tubulin Wprowadzenie Celem pracy było porównane bioczujnikowej metody enzymaty-cznej i metody HPLC do oznaczania wybranych pestycydów – chlor-fenwinfosu (CFV) i karbendazymu (MBC) - oraz mykotoksyny – aflatoksyny B1 (AFT B1). Pomiary bioczujnikowe w oparciu o inhibitowanie enzymu prowa-dzono z użyciem sitodrukowanego bioczujnika amperometrycznego z unieruchomioną esterazą acetylocholinową (AChE) różnego pocho-dzenia, gdzie wpływ na wybór odpowiedniego enzymu ma wartość stałej inhibicji ki dla oznaczanego analitu. Im wyższa wartość ki, tym enzym jest bardziej czuły na obecność oznaczanego inhibitora. Metodami inżynierii genetycznej można modyfikować enzymy tworząc odpowiednie mutanty, które wykazują różną czułość na wybrany inhibitor. Nieodwracalnie zinhibitowany enzym można w pewnym stopniu reaktywować poprzez zastosowanie odpowiednio dobranych odczynników takich, jak np. chlorek obidoksymu (Toxogonin) lub chlorek pralidoksymu (2-PAM). W chromatograficznej części pracy zoptymalizowano metody HPLC z detekcją UV do oznaczania CFV, MBC i AFT B1. Zastosowano je do określenia wydajności rozkładu badanych związków promieniowaniem γ oraz do identyfikacji produktów powstałych w napromieniowanych próbkach. Napromieniowanie γ roztworów wodnych prowadzi do radiolizy wody, wskutek czego powstają rodniki OH, H i solwatowany elektron, które reagują z cząsteczkami badanych związków, prowadząc do ich radiolitycznego rozkładu. Badano również zmiany toksyczności napromieniowanych roztworów z zastosowaniem bioluminescencji bakterii. OPTYMALIZACJA WARUNKÓW OZNACZEŃ PESTYCYDOW METODĄ HPLC CHLORFENWINFOS KARBENDAZYM A. Wybór długości fali B. Skład eluentu Eluent A: 2 g/L kwas cytrynowy + 5% ACN Eluent B: ACN (60 % -75 % w 7 min, w 11 min 100 %) Kolumna ODS 2, Luna (5 μm, 250 x 4.6 mm) Szybkość przepływu = 1 mL/min, objętość wstrzykiwanej próbki 50 μL, l= 250, 285 nm A. Wybór pH eluentu B. Skład eluentu Eluent A: Roztwór 10 mmol/L octanu amonu + 5% ACN, pH=8 Eluent B: ACN [5 % - 25 % w 30 min] Kolumna ODS 2, Luna (5 μm, 250 x 4.6 mm) F = 1mL/min, objętość próbki 100 µL Detekcja przy λ = 277 nm Chromatogram mieszaniny wzorców Chromatogram mieszaniny wzorców 6 2 3 4 5 --- 1 mg/l --- 5 mg/l 1 1 30 mg/l ---- 250 nm ---- 285 nm 2 3 Wyznaczone granice wykrywalności (µg/L) 1,2-fenylenodiamina 6,5 (tR = 9,4 min) 2) 2-aminobenzimidazol [2-AB[ 3,8 (tR = 12,0 min) 3) 2-hydroksy-benzimidazol [2-HB] 2.1 (tR = 14,5 min) 4) Benzimidazol 2,9 (tR = 14,9 min) 5) Anilina 9,7 (tR = 18,3 min) 6) Karbendazym [MBC] 1,8 (tR = 24,0 min) Wyznaczone granice wykrywalności (µg/L) Kwas 2,4-dichlorobenzoesowy (2,4-DCBA) 9,3 (tR = 5,7 min) 2) 2,4-dichlorofenol (2,4-DCP) 15 (tR = 6,8 min) 3) Chlorfenwinfos (CFV) 62 (tR = 11,6 min) OZNACZANIE BIOCZUJNIKIEM ENZYMATYCZNYM AFLATOKSYNA B1 – Inhibicja niekompetycyjna AChE z węgorza elektrycznego (eeAChE) AChE z mózgu myszy (bAChE) Wnioski W zoptymalizowanych warunkach metoda bioczujnikowa jest lepsza do oznaczania CFV pod względem granicy wykrywalności, lecz jest mało selektywna. Zastosowano ją do oznaczeń CFV i AFT B1 w próbkach naturalnych wód i papryki. Opracowane metody chromatograficzne zastoso-wano do badania wydajności oraz identyfikacji produktów radiolityczego rozkładu dwóch pestycy-dów. W obu przypadkach stwierdzono rozkład badanych analitów przy niskich dawkach pochło-niętego promieniowania g oraz zidentyfikowano szereg produktów rozkładu. Metodą chromatografii jonowej w napromieniowanych próbkach stwierdzono powstawanie jedynie śladowych ilości jonów azota-nowych i fosforanowych, co oznacza, że azot w karbendazymie, a także fosfor w chlorfenwinfosie pozostają w postaci związków organicznych. Wykonane pomiary toksyczności ostrej napromie-niowanych próbek bioluminescencyjnym testem Microtox, wskazują na nietoksyczność roztworów CFV i MBC na badanym poziomie stężeń oraz i ich produktów rozkładu radiolitycznego. ROZKŁAD RADIOLITYCZNY I IDENTYFIKACJA PRODUKTÓW ROZKŁADU CHLORFENWINFOS – Inhibicja nieodwracalna AChE z muszki owocowej (mutant B394) Nr piku tR (min) Nazwa związku 1 3,8 nieznany 2 5,4 2,4-DCBA 3 6,2 2,4-DCP 4 7,7 5 8,5 2,4-DCAP 6 9,3 2,2’,4’-TCAP 7 10,4 CFV 8 11,4 Nr piku tR (min) Nazwa związku 1 5,5/5,8 nieznany 2 12,8 2- AB 3 14,3 2-HB 4 15,1 5 18,3 anilina 6 19,4 7 21,1 8 24,8 MBC 1 2 3 4 5 6 7 8 250 nm 1 2 3 5 6 7 4 8 Wyznaczone granice wykrywalności CFV AFT B1 B394 AChE: 3,6 ng/l eeAChE: 94 µg/l bAChE: 156 µg/l Część badań eksperymentalnych niniejszej pracy wykonano na Uniwersytecie w Perpignan, w ramach stażu w programie ERASMUS, natomiast badania rozkładu radiolitycznego w Instytucie Chemii i Techniki Jądrowej w Warszawie. --- bez dodatku wzorców --- z dodatkiem 2,4DCBA, 2,4-DCP, CFV --- z dodatkiem 2, 2’,4’-TCAP --- z dodatkiem 2,4-DCAP --- 0,2 kGy, --- 0,4 kGy, --- wzorce 0,5 mg/l