Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej Pracownia Analizy Przepływowej i Chromatografii Kierownik pracy: prof. dr hab. Marek Trojanowicz Opiekun pracy: dr Ewa Poboży Ignacy Rzygaliński Wprowadzenie ABTS jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP) β-NADH jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP) GOx GOx Przedmiotem pracy było opracowanie metody derywatyzacji enzymatycznej w wysokosprawnej elektroforezie kapilarnej z detekcją spektrofotometryczną w celu ilościowego oznaczania substratów oksydaz. Reakcje derywatyzacji enzymatycznej przeprowadzano bezpośrednio w kapilarze, stanowiącej swoisty mikroreaktor zgodnie z opisaną wcześniej w literaturze procedurą EMMA (Electrophoretically Mediated Microanalysis). Stosowano różne sposoby prowadzenia reakcji - metodę ciągłego kontaktu reagentów, jak i metodę przenikających się stref. Wykorzystano układ bienzymatyczny oksydaza – peroksydaza z różnymi markerami detekcji oznaczanego związku. Jako związek modelowy wybrano glukozę w celu jej ilościowego oznaczenia jako substratu reakcji utleniania w obecności oksydazy glukozowej (GOx). Zbadano trzy rodzaje układów pozwalających na uzyskanie sygnału spektrofotometrycznego, przy czym zawsze pierwszą reakcją zachodzącą w układzie była: D-glukoza + O2 D-glukono-1,5-lakton + H2O2 Następna reakcja enzymatyczna miała na celu umożliwienie spektrofotometrycznej detekcji powstającego nadtlenku wodoru. W tym celu zastosowano drugi enzym, peroksydazę chrzanową (HRP), która katalizuje reakcje utleniania różnych związków za pomocą H2O2. Wykorzystano trzy różne substraty peroksydazy chrzanowej: kwas 2,2’-azyno-bis(3-etyleno-tiazolino-6-sulfonowy) (ABTS); dinukleotyd nikotyno-amidoadeninowy w formie zredukowanej (NADH) oraz 1,2,3-trihydroksybenzen (pirogalol). W zależności od właściwości absorpcyjnych powstających produktów, detekcję prowadzono przy różnej długości fali. Sygnał uzyskiwany od powstającego produktu jest proporcjonalny do zawartości D-glukozy w próbce. W warunkach takich możliwe są oznaczenia glukozy w zakresie stężeń od 0,005 do 0,1 mmol/L. D-Glukoza + O2 D-Glukono-1,5-lakton + H2O2 H2O2 + ABTS(red) H2O + ABTS(ox) ABTS(ox) + β-NADH ABTS(red) + β-NAD D-Glukoza + O2 D-Glukono-1,5-lakton + H2O2 H2O2 + β-NADH H2O + β-NAD HRP HRP detekcja l = 260 nm Metoda ciągłego kontaktu reagentów detekcja l = 260 nm β-NAD Metoda ciągłego kontaktu reagentów Metoda klasyczna strefa - strefa Wstrzyknięcie: GOx (75 U/ml) HRP (488 U/ml) ABTS(red) (1 mM) BGE: HEPES (30 mM, pH=7) β-NADH (1mM) GLUKOZA Wstrzyknięcie: GOx (75 U/ml) HRP (488 U/ml) ABTS(red) (1 mM) BGE: HEPES (30 mM pH=7) Przykładowe elektroferogramy zarejestrowane dla różnych stężeń glukozy β-NADH (1 mM) GLUKOZA β-NAD Reakcja u wlotu kapilary β-NAD Optymalizacja czasu inkubacji GOx β-NAD Przykładowe elektroferogramy zarejestrowane dla różnych stężeń glukozy Przykładowe elektroferogramy zarejestrowane dla różnych stężeń glukozy Zależność powierzchni piku uzyskiwanego sygnału od czasu inkubacji u wlotu kapilary Przykładowe elektroferogramy dla różnych stężeń glukozy (czas inkubacji 3 min) Trudności obserwowane np. brak liniowości uzyskiwanego sygnału wynikają z: reakcji ubocznych utleniania ABTS(red) tlenem reakcji ubocznych utleniania NADH w obecności HRP zarówno H2O2, jak i tlenem Zależność powierzchni piku od stężenia glukozy (0,001-0,1 mM) Metoda EMMA (Electrophoretically mediated microanalysis) Pirogalol jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP) Różne sposoby prowadzenia reakcji enzymatycznej w kapilarze: Metoda ciągłego kontaktu (continous mode) Zastosowanie β-NADH jako bezpośredniego substratu peroksydazy chrzanowej pozwoliło ograniczyć układ do dwóch reakcji. Nie udało się wyeliminować problemów związanych z niepożądanymi reakcjami ubocznymi utleniania β-NADH również tlenem, a nie tylko powstającym w wyniku pierwszej reakcji nadtlenkiem wodoru. GOx D-Glukoza + O2 D-Glukono-1,5-lakton + H2O2 ENZ HRP Substrat znajduje się w BGE, zaś enzym wstrzykiwany jest w postaci strefy Substrat w BGE Substrat w BGE Część eksperymentalną pracy magisterskiej wykonano na przyrządzie do elektroforezy kapilarnej Beckman P/ACE MDQ z matrycowym detektorem diodowym UV-Vis. detekcja l = 304 nm pirogalol purpurogalina Warunki rozdzielania Kapilara niemodyfikowana : l = 50 / 60 cm; i.d.=75 µm. Napięcie: +30 kV. Temperatura: +35,7 °C. Wstrzykiwanie hydrodynamiczne. Roztwory wzorcowe pirogalolu i purpurogaliny Reakcja u wlotu kapilary Metoda przenikających się stref (plug-plug mode) Metoda klasyczna strefa–strefa (classic plug–plug) Reakcja u wlotu kapilary (at-inlet reaction) pirogalol purpurogalina enzymy Wnioski Pierwszy wsztrzykiwany jest reagent wolniejszy 3 min 304 nm Podjęto próbę derywatyzacji enzymatycznej w elektroforetycznych oznaczeniach glukozy z zastosowaniem oksydazy glukozowej i 3 różnych substratów peroksydazy chrzanowej. Dla dwóch z nich - ABTS i ß-NADH - uzyskano sygnały umożliwiające ilościowe oznaczenie glukozy. Zastosowanie pirogalolu nie przyniosło oczekiwanych rezultatów. W przypadku wykorzystania ABTS jako substratu HRP konieczne jest przeprowadzenie dodatkowej reakcji. Zastosowanie ß-NADH jako substratu peroksydazy znacznie uprościło układ, pozwalając tym samym na uzyskanie lepszych wyników. Nie udało się jednak wyeliminować trudności związanych z ubocznymi reakcjami utleniania ß-NADH tlenem. 1 min SUB 214 nm ENZ INKUBACJA EOF EOF Elektroferogramy roztworu wzorcowego mieszaniny pirogalolu i purpurogaliny Elektroferogramy zarejestrowane dla różnych czasów inkubacji u wlotu kapilary BGE BGE BGE BGE - - + + Nie udało się uzyskać oczekiwanego sygnału od purpurogaliny. Widoczne jest tylko zgrubienie mogące pochodzić od strefy powstającego produktu. PROD PROD