Aktywność katalityczna enzymów Enzymologia-1 Informacje wstępne Aktywność katalityczna enzymów

Biokatalizatory: Enzymy – zbudowane z aminokwasów (białka) Rybozymy – zbudowane z rybonukleotydów (RNA) DNA-enzymy – zbudowane z deoksyrybonukleotydów

Ważne daty z historii enzymologii Kuhne – wprowadzenie terminu „enzym” 1894 Fisher – teoria „klucza i zamka” 1897 Buchner – wykazanie, że ekstrakt drożdżowy może katalizować fermentację alkoholową 1913 Michaelis, Menten – podstawy matematycznej analizy kinetyki reakcji enz, 1926 Sumner – pierwsze otrzymanie enzymu w formie krystalicznej (ureaza) 1928 Svedberg – skonstruowanie ultrawirówki 1958 Koshland – teoria „wzbudzonego dopasowania” 1960 Stein, Moore – pierwsze określenie sekwencji aminokwasowej enzymu 1965 Pierwsze określenie struktury przestrzennej enzymu (lizozym) na podstawie danych krystalograficznych. Pierwsza struktura białka (mioglobina) została określona 5 lat wcześniej (Kendrew i in.) 1965 Jacob, Monod – odkrycie zjawiska allosterycznej regulacji aktywności enzymów 1969 Merrifield – chemiczna synteza enzymu (rybonukleaza) 1970 – 1975 pierwsze wyjaśnienia mechanizmów działania enzymów 1970 Wilchek, Cuatrecas – opracowanie techniki chromatografii powinowactwa 1980 – 1985 zastosowanie technik rekombinacji DNA w badaniach enzymologicznych (układy nadekspresyjne, ukierunkowana mutageneza 1986 Cech – odkrycie rybozymu

Enzymy są „superkatalizatorami” niezwykle duża efektywność katalizy wysoka aktywność katalityczna w umiarkowanych warunkach swoistość reakcji specyficzność substratowa stereospecyficzność praktycznie 100% wydajność; brak produktów ubocznych

SWOISTOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNYCH   L-asparaginaza EC 3.5.1.1

SWOISTOŚĆ SUBSTRATOWA   L-asparaginaza EC 3.3.1.1

Stereospecyficzność działania enzymów

Niektóre zlokalizowane są w błonach biologicznych Niektóre są białkami rozpuszczalnymi - globularnymi

Niektóre enzymy pomagają przemieszczać się substratom, półproduktom i produktom Enzymy oligomeryczne Enzym z kanałem wewnętrznym

Topoizomeraza – enzym skręcający i rozkręcający DNA

Polimeraza DNA – enzym łączący nukleotydy na podstawie sekwencji matrycy

Podobieństwo struktur przestrzennych enzymów Struktury racemazy kwasu mandelowego I enzymu laktonizujacego kwas mukonowy Struktury dwóch proteaz serynowych: chymotrypsyny i subtilizyny

Dlaczego enzymy są tak efektywnymi katalizatorami? grupy funkcyjne w centrum aktywnym hydrofobowy charakter centrum aktywnego współdziałanie koenzymów kataliza kwasowo-zasadowa maksymalne zbliżenie i optymalne ustawienie substratu(ów) wzbudzone dopasowane enzymu

W centrum aktywnym enzymu znajdują się reszty wiążące substrat(y) i koenzym Wiązanie koenzymu i substratu przez aminotransferazę kwasu asparaginowego Wiązanie substratu przez racemazę kwasu mandelanowego

Niektóre enzymy potrzebują pomocników... Koenzym – niewielka cząsteczka organiczna współpracująca z cząsteczką enzymu podczas aktu katalitycznego, której obecność jest niezbędna dla katalizy. Koenzym wiąże się z enzymem tylko w trakcie aktu katalitycznego Grupa prostetyczna – cząsteczka organiczna lub jon metalu niezbędna dla działania enzymu, połączona trwale z cząsteczka enzymu

Niektóre enzymy potrzebują pomocników... Jony metali jako grupy prostetyczne enzymów

Szybkość reakcji enzymatycznej Enzym, podobnie jak każdy inny katalizator, przyśpiesza reakcję, ale nie zmienia jej stanu równowagi. Enzymy katalizują jedynie reakcje termodynamicznie możliwe, czyli takie, dla których G0. Uwaga: enzymy w komórkach mogą katalizować reakcje, dla których G>0. Warunek: sprzężenie z reakcją, dla której G<0. Warunkiem zajścia reakcji jest efektywne zderzenie cząsteczek (cząsteczki muszą posiadać odpowiednią energię oraz być odpowiednio ustawione względem siebie) Najmniejsza energia, którą należy dostarczyć molowi substratów, aby każda z cząsteczek stała się reaktywna – energia aktywacji Szybkość reakcji zależy od energii aktywacji układu. v = f (G*)

Enzymy obniżają energię aktywacji układu   Energia aktywacji (kJ/mol) Połowiczny czas reakcji I rzędu w 27C 62.7 83.6 104.5 125.4 0.007 s 14 s 19 h 38 h Energia aktywacji a szybkość reakcji Energię aktywacji można wyznaczyć k = A exp(-G*/RT) ln k = f(1/T)  G*

Enzymy obniżają energię aktywacji układu

Oddziaływanie enzym: substrat Teoria wzbudzonego dopasowania Teoria klucza i zamka

Enzym wiążąc substrat przyjmuje konformację komplementarną do stanu przejściowego

Enzym przyciąga substrat do centrum aktywnego Sposoby oddziaływań elektrostatycznych enzymu z substratem Rozkład potencjału elektrostatycznego wokół enzymu – dysmutazy nadtlenkowej Pokazano obszary potencjału dodatniego i ujemnego. Substrat: O2-. jest naładowany ujemnie Efekt Kirke

Wykres zależności szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od stężenia substratu ma kształt hiperboliczny

Wykres zależności szybkości reakcji katalizowanej przez enzym allosteryczny od stężenia substratu ma kształt sigmoidalny

Czynniki wpływające na aktywność enzymu temperatura odczyn środowiska potencjał redoks Zależność aktywności enzymu od temperatury Zależność aktywności enzymu od pH Kształt wykresu v = f(T) może się zmieniać w zależności od momentu pomiaru

Aktywność enzymów może być hamowana

Aktywność enzymu może być regulowana Regulacja allosteryczna Stosunkowo niewielkie cząsteczki – ligandy allosteryczne - wiążą się z enzymami oligomerycznymi, zwiększając lub zmniejszając ich aktywność. Regulacja ma charakter płynny. Dotyczy często enzymu katalizującego pierwszą reakcję w szlaku biosyntetycznym. Regulacja kowalencyjna Enzym traci lub zyskuje aktywność w wyniku odłączenia lub przyłączenia małej grupy funkcyjnej, katalizowanego przez inny enzym. Regulacja ma najczęściej charakter zero-jedynkowy.

[Aktywność molekularna] = U/mol = min-1 Aktywność enzymu – ilość enzymu katalizująca przekształcenie 1 mola substratu w produkt w jednostce czasu. Jeżeli jednostką czasu jest 1 min, to aktywność jest wyrażona w jednostkach U [U] = mol/min; w układzie SI  katal = mol/s 1 katal = 6  107 U Aktywność molekularna – liczba cząsteczek substratu przekształcona w produkt w czasie 1 min przez 1 cząsteczkę enzymu w optymalnych warunkach  Nazwa stosowana poprzednio – liczba obrotów [Aktywność molekularna] = U/mol = min-1

Aktywność molekularna  60 = kkat Stała katalityczna   Stała katalityczna określa liczbę mikromoli substratu przekształconych przez 1 mol enzymu w produkt w ciągu 1 sekundy w optymalnych warunkach kkat = V/[E] [kkat] = s-1 Aktywność molekularna  60 = kkat Dla enzymów zawierających więcej niż jedno centrum katalityczne   Aktywność centrum katalit. = aktywność molekularna/liczba centrów

Izoenzymy Różne formy tego samego enzymu występujące w różnych organelach komórki lub różnych tkankach tego samego organizmu. Izoenzymy mogą się różnić m.in. strukturą przestrzenną, stopniem ufosforylowania, sposobem regulacji aktywności. Różnice te są konsekwencją niewielkich zmian struktury I-rzędowej.

Autokatalityczne introny Rybozymy typu „głowa młotka” i enzymy DNA Rybozymy i enzymy DNA Cząsteczki RNA lub DNA wykazujące aktywność autokatalityczną lub katalityczną RNaza P Autokatalityczne introny Rybozymy typu „głowa młotka” i enzymy DNA Transferaza peptydylowa w rybosomie

Autokatalityczne introny Struktura autokatalitycznego intronu z prekursora rRNA Tetrahymena, wycinającego się bez pomocy białek Mechanizm autokatalitycznego splicingu

Niektóre rybozymy i enzymy DNA przecinają mRNA Modele struktur II-rzędowych rybozymu typu „głowa młotka” (ang. hammerhead) i enzymu DNA Konformacja zwiniętego kompleksu rybozymu typu „głowa młotka” z mRNA

Transferaza peptydylowa – największy rybozym

Rybosom

Obraz miejsca tworzenia wiązania peptydowego w rybosomie