Medyczne aspekty enzymologii Enzymologia-14 Medyczne aspekty enzymologii

   1. Zastosowania diagnostyczne:       - oznaczanie aktywności enzymów jako element diagnozy       - enzymy jako bioodczynniki dla oznaczania stężenia metabolitów   2. Choroby, których przyczyną jest deficyt enzymatyczny   3. Enzymy jako leki        - usuwanie substancji toksycznych        - leczenie objawów chorób deficytu enzymatycznego        - terapia przeciwnowotworowa

Przykłady enzymów stosowanych w diagnostyce Enzym Źródło (oryginalne) Stosowany do oznaczania ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Oksydaza cholesterolowa Nocardia erythropolis Cholesterol lub Brevibacterium spp. Kreatynaza Pseudomonas spp. kreatyna Kreatyninaza j.w. kreatynina -galaktozydaza E. coli jony Na+, ELISA Oksydaza glukozowa Aspergillus niger glukoza Dehydrogenaza Glc-6-P Leuconostoc mesenteroides glukoza -glukozydaza S. cerevisiae aktywność -amylazy Oksydaza glicerolo-3-P Aerococcus viridians triacyloglicerole Heksokinaza S. cerevisiae glukoza Peroksydaza Chrzan enzym wskaźnikowy, testy ELISA Oksydaza pirogronianowa Pediococcus spp. pirogronian, transaminazy Oksydaza kwasu moczowego Arthrobacter protopharmiae kwas moczowy Ureaza Klebsiella aerogenes mocznik

Pomiary aktywności enzymów przydatne w diagnostyce klinicznej   Nekroza komórek – następuje uwolnienie wszystkich enzymów Stan zapalny – następuje zmiana przepuszczalności błony cytoplazmatycznej i uwolnienie enzymów cytoplazmy Warunki jakie powinien spełniać enzym przydatny dla celów diagnostyki klinicznej     - enzym powinien być obecny we krwi, moczu lub innych łatwo osiągalnych płynach ustrojowych;      - względna łatwość oznaczania;      - znaczące różnice poziomów aktywności w stanie patologicznym i normalnym;      - stabilność enzymu w płynie ustrojowym      - pożądana cecha – specyficzność tkankowa

Aminotransferaza alaninowa, ALAT Enzym zawarty gł. w komórkach wątroby i mięśnia sercowego. Zwiększenie jego aktywności w krwi powyżej dopuszczalnej granicy przemawia za uszkodzeniem rozlanym lub martwicą jednego z tych narządów. Ma zastosowanie w diagnostyce zapaleń wątroby oraz zawału mięśnia sercowego.

Aminotransferaza asparaginianowa, AspAT Enzym zawarty gł. we włóknach mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych, a także w komórkach wątroby i in. narządów. Zawał serca - wypłukiwanie enzymu z rozpadających się włókien mięśnia sercowego - wzrost aktywności enzymu w surowicy krwi Zjawisko to jest czułym wskaźnikiem martwicy mięśnia sercowego, występującej w 100% przypadków rozległego zawału, ale tylko w ciągu pierwszych kilku dni choroby (później aktywność spada do normy). W uszkodzeniach innych narządów, np. wątroby, aktywność AspAT wzrasta mniej znacznie.

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) Enzym, którego aktywność we krwi wzrasta we wczesnym okresie zawału mięśnia sercowego (norma 1333-4000 nkat/l = 80-240 U/l), a także w stanach nadmiernego rozpadu krwinek czerwonych, czyli ich hemolizy. Kinaza fosfokreatyninowa, CPK Enzym, którego wzrost aktywności w surowicy krwi, powyżej 50 jednostek, jest czułym wskaźnikiem martwicy zawałowej mięśnia sercowego w kilku pierwszych dniach choroby.

Diagnostyka chorób wątroby aminotransferaza asparaginianowa        aminotransferaza asparaginianowa       aminotransferaza alaninowa      fosfataza alkaliczna -glutamylotranspeptydaza S-transferaza glutationowa Znaczenie diagnostyczne: wirusowe zapalenie wątroby, marskość wątroby, żółtaczka mechaniczna

Oznaczanie aminotransferaz: reakcje sprzężone z reakcjami katalizowanymi przez dehydrogenazy NADH-zależne. Pomiar absorpcji przy 340 nm   Oznaczanie fosfatazy: sztuczny substrat – p-nitrofenylofosforan. Hydroliza uwalnia p-nitrofenol, który w środowisku alkalicznym absorbuje przy 410 nm

Oznaczanie -glutamylotranspeptydazy Gly

Inne tkanki: mięsień sercowy   mięsień sercowy kinaza kreatynowa, aminotransferaza asparaginianowa, dehydrogenaza mleczanowa (zawał mięśnia sercowego) trzustka -amylaza (ostre zapalenie trzustki) prostata fosfataza kwaśna (rak prostaty). Rozróżnienie fosfatazy pochodzącej z prostaty od enzymu z innych tkanek: winian jest inhibitorem enzymu z prostaty, a formaldehyd enzymu z erytrocytów

Oznaczanie metabolitów   Glukoza 1. Reakcja sprzężona 2. Reakcja barwna 3. Reakcja wykorzystująca dehydrogenazę glukozową z B. cereus

Kwas moczowy Mocznik Pomiar: Bezpośrednio, spektrofotometrycznie – 293 nm (UV) Sprzężenie z reakcją katalizowaną przez peroksydazę (reakcja barwna) Mocznik Pomiar: Sprzężenie z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę kwasu glutaminowego, w której substratem jest jon amonowy. oznaczenie tworzącego się NAD+ przy 340 nm (UV) Immobilizowana ureaza. Tworzący się amoniak dyfunduje przez półprzepuszczalna błonę, gdzie reaguje z barwnikiem indykatorowym

Cholesterol

Typowe zmiany aktywności we krwi enzymów uwolnionych w wyniku zawału mięśnia sercowego

ELISA – wersja kompetytywna

ELISA – wersja „sandwich”

DEFEKTY GENETYCZNE OBJAWIAJĄCE SIĘ BRAKIEM ENZYMÓW

Albinizm

DEFEKTY GENETYCZNE OBJAWIAJĄCE SIĘ BRAKIEM ENZYMÓW Zwłóknienie torbielowate (cystic fibrosis) – brak białka transbłonowego regulującego przepływ anionów. Efekt – gromadzenie się śluzu w płucach, blokada kanałów trzustkowych

Enzymy jako leki Usuwanie tkanki nekrotycznej z wykorzystaniem enzymów proteolitycznych Usuwanie skrzepów w naczyniach krwionośnych (streptokinaza, urokinaza) Stany niewydolności trzustki – podawanie kapsułkowanych enzymów trawiennych

Pepsyna rozkłada białka do polipeptydów Pepsyna rozkłada białka do polipeptydów. Stosowana jest w leczeniu niedokwaśności soku żołądkowego, najczęściej razem z kwasem solnym. Streptokinaza, fibrynolizyna, proteina wytwarzana przez paciorkowce, enzym aktywujący plazminogen, który w stanie czynnym rozpuszcza skrzepy włóknika, a także inne proteiny. Streptokinaza wyosobniona w czynnej postaci stanowi lek stosowany w celu przyspieszenia wchłaniania krwiaków.

Enzymy w terapii przeciwnowotworowej Zastosowanie asparaginazy w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej i ostrej białaczki granulocytarnej Działanie asparaginazy bazuje na fakcie, że zmutowane komórki białaczkowe nie są zdolne do syntezy Asn, podczas gdy zdrowe komórki wytwarzają własną asparaginę. Tak więc zmutowane komórki zależą od wolnej asparaginy cyrkulującej w organizmie. Asparaginaza katalizuje rozkład L-asparaginy do kwasu asparaginowego i amoniaku, co likwiduje wolną asparaginę w organizmie.

2. Aktywacja pro-leków

Przykłady proleków i aktywujących enzymów Fosforan etopozydu fosfataza alkaliczna 5-fluorocytozyna deaminaza cytozynowa 2-(L--aminoacylo)metotreksat aminopeptydaza

Przykładami wykorzystania proleków w terapii jest: prontosil, króry przekształcany jest w organizmie w aktywny związek przeciwbakteryjny sulfanilamid. enalapryl podawany jako prolek, a właściwe działanie biologiczne wykazuje enalaprylat (powstały w wyniku działania esteraz) lewodopa, która zostaje poddana dekarboksylacji w organizmie do dopaminy. heroina, która zostaje deacetylowana do morfiny